Site-specific integration of rotavirus VP6 gene in rabbit β-casein locus by CRISPR/Cas9 system

Liu, Hongli; Li, Zhipeng; Xiao, Ning; Su, Xiaoping; Zhao, Shanshan; Zhang, Yu; Cui, Kuiqing; Liu, Qingyou; Shi, Dongquan

doi:10.1007/s11626-019-00382-z

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“…O CRISPR/Cas9 é uma ferramenta muito vantajosa na edição de genes por ser um sistema específico capaz de mediar o knock-in em um alvo de interesse, podendo ser utilizado em qualquer tipo de célula e região genômica. Além disso, é mais simples que os demais métodos de edição de genes descritos até o presente momento (meganucleases, nucleases, Zinc-finger e TALENs), já que essa técnica só necessita da Cas9 e o gRNA específico (LI et al, 2019a).…”

Section: Crispr/casunclassified

Edição gênica em células de bovinos para inserção de genes de interesse no Locus H11 do genoma bovino

Silva¹,

Müller²,

Fidelis³

et al. 2022

PIC

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A pecuária bovina tem grande influência nas exportações brasileiras e consequentemente na economia do país. As doenças infecciosas e parasitárias se tornam grandes impedimentos para o crescimento da atividade, uma vez que afetam significativamente a produtividade dos animais. Com o desenvolvimento de novas biotecnologias, é possível a aplicação de técnicas para obtenção de animais geneticamente modificados, uma vez que a transgenia animal é uma ferramenta relevante para a obtenção de animais mais resistentes a fatores abióticos e bióticos. Dentre as técnicas mais atuais de edição e modificação de genes podemos citar a CRISPR/Cas9. A técnica de CRISPR foi descoberta através de uma análise de como o sistema imunológico da bactéria funciona contra vírus, que insere seu material genético no genoma da bactéria e serve de molde para o gRNA, que se une com a Cas9 e procura uma sequência complementar no genoma de outro vírus infectante para gerar uma quebra na fita, podendo resultar em inserções ou deleções de genes. Para a realização da técnica de CRISPR/Cas9, é necessário um fluxo de trabalho para triagem, composto por etapas fundamentais: construção e sequenciamento dos vetores, produção dos guias para Cas9 e dos primers; transformação do vetor; transfecção de células; amplificação por PCR e ensaios de digestão com enzima endonuclease T7E1 para avaliar a edição genômica realizada. No laboratório ela pode ser usada através de transfecção celular, um método que possibilita o transporte de genes exógenos para dentro das células de interesse, para isso o ensaio de digestão com a enzima T7Endonuclease1 (T7E1) é utilizada, já que reconhece e corta as regiões do DNA que não foram pareadas de forma correta na etapa anterior (PCR), possibilitando identificar as regiões que tiveram sucesso na indução de edição nos genes alvos. O objetivo da pesquisa foi investigar a aplicação do sistema CRISPR/Cas para edição genômica e estabelecer a metodologia mais eficiente para inserir o gene de interesse em um local específico e seguro do genoma denominado locus H11, para que futuramente seja possível produzir embriões bovinos transgênicos. Este trabalho demonstrou que os testes e análises para padronização dos procedimentos e a escolha dos melhores parâmetros são extremamente importantes. Os resultados mostram que é importante saber a origem da célula transfectada, já que cúmulus apresentou bandas fantasmas e impossibilitou a análise de edição. Quanto a transfecção, o melhor reagente foi o Xfect armazenado no congelador que apesar de não apresentar uma mortalidade celular ideal. Além disso, ficou comprovado também a importância de um controle positivo da enzima T7E1 e do controle negativo com DNA de células não transfectadas no ensaio de digestão. A confirmação da expressão heteróloga de genes de interesse e da edição genômica não foi possível até o momento, mas pode-se concluir que a técnica de CRISPR é uma ferramenta de fácil execução e relativamente rápida, e com os melhores parâmetros definidos, valida a abordagem para experimentos futuros.

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Section: Crispr/casunclassified

Edição gênica em células de bovinos para inserção de genes de interesse no Locus H11 do genoma bovino

Silva¹,

Müller²,

Fidelis³

et al. 2022

PIC

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“…Therefore, several alternative transgenic methods to pronuclear microinjection for improvement of the transgenic efficiency and stability have been explored in rabbits. For example, the sperm vector [12,33,34], ICSI-mediated transgenesis [35,36], transgenesis by somatic cell nuclear transfer (SCNT) [37] or chimeric SCNT [13,38], lentiviral vectors [14], transposon-mediated transgenesis [15,39], and novel genome editing technology [16,40,41] have been examined to produce transgenic rabbits. The characteristics of these major historical techniques are summarized in Table 1.…”

Section: Traditional Pronuclear Microinjection To Generate Transgenic Rabbitsmentioning

confidence: 99%

“…High efficiency (26.3-35.0% of total born rabbits and 6.8-7.0% of total injected embryos) Off-target effects remain. [16,40,41] SMGT, sperm-mediated gene transfer; TMGT, testis-mediated gene transfer; ICSI, intracytoplasmic sperm injection; SNCT, somatic cell nuclear transfer; CRISPR, clustered regularly interspaced short palindromic repeats.…”

Section: Knock-in Rabbitsmentioning

confidence: 99%

Transgenic Rabbit Models: Now and the Future

et al. 2020

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Transgenic rabbits have contributed to the progress of biomedical science as human disease models because of their unique features, such as the lipid metabolism system similar to humans and medium body size that facilitates handling and experimental manipulation. In fact, many useful transgenic rabbits have been generated and used in research fields such as lipid metabolism and atherosclerosis, cardiac failure, immunology, and oncogenesis. However, there have been long-term problems, namely that the transgenic efficiency when using pronuclear microinjection is low compared with transgenic mice and production of knockout rabbits is impossible owing to the lack of embryonic stem cells for gene targeting in rabbits. Despite these limitations, the emergence of novel genome editing technology has changed the production of genetically modified animals including the rabbit. We are finally able to produce both transgenic and knockout rabbit models to analyze gain- and loss-of-functions of specific genes. It is expected that the use of genetically modified rabbits will extend to various research fields. In this review, we describe the unique features of rabbits as laboratory animals, the current status of their development and use, and future perspectives of transgenic rabbit models for human diseases.

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“…Rectal introduction of partially purified milk proteins VP2 and VP6NG (non-glycosylated form) with an adjuvant almost completely prevented diarrhea in mice infected with a mouse strain of the virus [17,18]. In 2019, GM rabbits with the VP6 gene integrated into the βcasein locus (CSN2) were obtained using the CRISPR / Cas9 technology to create a rotavirus vaccine suitable for both mammary-gland-based production and milk-based introduction [19]. For this purpose, there were used microinjection containing Cas9 in the form of mRNA or protein, sgRNA, and a donor DNA vector with the VP6 gene into the cytoplasm of rabbit zygotes.…”

Section: Introductionmentioning

confidence: 99%

Genetically modified rabbits as bio-producers and biomodels

et al. 2020

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Genetically modified (GM) animals are necessary to solve the global problems of humanity related to nutrition and health. Rabbits, as laboratory, domestic and farm animals, occupy a special niche in research. GM rabbits are promising as bioreactors for producing biologically active (BA) proteins with milk or blood, and are in demand in Biomedicine as biomodels of diseases. To date, many GM rabbits-biomodels, producers of recombinant proteins have been created in the world using CRISPR/Cas9 technology. All-Russian Research Institute of Animal Physiology, Biochemistry and Nutrition has experience in obtaining transgenic rabbitsproducers of human BA proteins with milk by microinjecting recombinant DNA into zygote pronuclei. The possibility of site-specific modification of the rabbit whey acidic protein (WAP) gene using CRISPR/Cas9 technology is discussed. A DNA matrix containing homology arms to the WAP rabbit gene and site-specific CRISPR/Cas9 components in plasmid form were obtained. Microinjections of rabbit zygotes were performed and embryo survival was evaluated in vitro. The efficiency of using the green fluorescent protein gene under the cytomegalovirus promoter in the DNA matrix as an indicator of homologically directed repair was evaluated. This work can be useful for obtaining rabbits that produce with milk BA protein instead of WAP.

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Site-specific integration of rotavirus VP6 gene in rabbit β-casein locus by CRISPR/Cas9 system

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Edição gênica em células de bovinos para inserção de genes de interesse no Locus H11 do genoma bovino

Edição gênica em células de bovinos para inserção de genes de interesse no Locus H11 do genoma bovino

Transgenic Rabbit Models: Now and the Future

Genetically modified rabbits as bio-producers and biomodels

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