Snapshots of the Fluorosalinosporamide/20S Complex Offer Mechanistic Insights for Fine Tuning Proteasome Inhibition

Abstract

Many marketed drugs contain fluorine, reflecting its ability to modulate a variety of biological responses. The unique 20S proteasome inhibition profile of fluorosalinosporamide compared to chlorinated anticancer agent salinosporamide A (NPI-0052) is exemplary and relates to each halogen's leaving group potential. Crystal structures of fluoro-, hydroxy-, and bromosalinosporamide in complex with the yeast 20S proteasome core particle (CP) provide mechanistic insights into ligand binding and leaving group elimination and the ability to fine-tune the duration of proteasome inhibition. Fluorosalinosporamide/CP crystal structures determined over time offer striking snapshots of the ligand trapped with an intact fluoroethyl group in anticipation of fluoride elimination, followed by complete nucleophilic displacement of fluoride to give the highly stabilized cyclic ether found for salinosporamide A and bromosalinosporamide. This two-step reaction pathway is consistent with a mechanism for partially reversible proteasome inhibition by fluorosalinosporamide. Proteasome catalyzed fluoride displacement provides preliminary insights into the active site Thr1N pK(a).

Proteasome Regulator Marizomib (NPI-0052) Exhibits Prolonged Inhibition, Attenuated Efflux, and Greater Cytotoxicity than Its Reversible Analogs

“…1B, pathway B) or aqueous hydrolysis (Fig. 1B, pathway C), with steric interference by C-3O attenuating the latter (Groll et al, 2006(Groll et al, , 2009Manam et al, 2008). These competing pathways for cleaving the inhibitorproteasome ester linkage are catalyzed by the free N terminus (Thr1NH 2 ).…”

“…The ␤-lactone ring is unable to reform, because C-3O is confined within the cyclic ether ring, and aqueous hydrolysis is limited by steric interference by C-3O, together with a catalytically inactivated (protonated, at least temporally) N terminus (Thr1NH 3 ϩ ). As a result, marizomib and other LG analogs become irreversibly bound (Groll et al, 2006(Groll et al, , 2009Manam et al, 2008).…”

Enzyme Inhibition by Hydroamination: Design and Mechanism of a Hybrid Carmaphycin-Syringolin Enone Proteasome Inhibitor

“…The modulated reactivity observed with compound 4 is somewhat reminiscent of the potent proteasome inhibitor fluorosalinosporamide, which also reacts with the proteasome in a two-step reaction mechanism involving a fast and reversible attachment to Thr1 followed by a slow and irreversible fluoride displacement reaction (Eustaquio and Moore, 2008, Groll et al, 2009). A major difference between these two inhibitors involves the nature of the reversibility of the initial proteasome adducts.…”

Salinosporamid‐Naturstoffe: potente Inhibitoren des 20S‐Proteasoms als vielversprechende Krebs‐Chemotherapeutika

“…[113] Während Nicht-LGSubstrate in diesen Assays im Laufe der Zeit erwiesenermaßen entfernt wurden -was letztlich zu einer kompletten Wiederherstellung der Proteasomaktivität führt -und LGhaltige Analoga ihre Hemmwirkung beibehalten, erlangte mit 145 behandeltes Proteasom seine Aktivität teilweise zurück. Eine Erklärung für diese Beobachtung lieferten kristallographische Studien: [119] Eine Analyse der b5-Untereinheit des Proteasoms nach einstündigem Einweichen des Kristalls zeigte 145 an das Protein über eine Esterbindung gebunden, allerdings mit noch intakter Fluorethylseitenkette. Dennoch schien der Inhibitor für eine folgende Verdrängung des Fluorsubstituenten perfekt im aktiven Zentrum ausgerichtet zu sein: die Fluorethyl-Seitenkette in einer klar definierten Position, mit der tertiären Hydroxygruppe im Vander-Waals-Abstand zur C2-Seitenkette, Thr1NH 2 innerhalb des Abstands für die Bildung einer Wasserstoffbrücke zur Hydroxygruppe und dem Fluoratom in räumlicher Nähe zu einem Netz aus Wassermolekülen, die eine Rolle bei der Solvatisierung von Fluorid nach der Fluoreliminierung spielen könnten.…”

“…Dennoch schien der Inhibitor für eine folgende Verdrängung des Fluorsubstituenten perfekt im aktiven Zentrum ausgerichtet zu sein: die Fluorethyl-Seitenkette in einer klar definierten Position, mit der tertiären Hydroxygruppe im Vander-Waals-Abstand zur C2-Seitenkette, Thr1NH 2 innerhalb des Abstands für die Bildung einer Wasserstoffbrücke zur Hydroxygruppe und dem Fluoratom in räumlicher Nähe zu einem Netz aus Wassermolekülen, die eine Rolle bei der Solvatisierung von Fluorid nach der Fluoreliminierung spielen könnten. [119] Kristalle zeigten nach 24-stündigem Einweichen tatsächlich eine komplette Verdrängung des Fluoratoms [a] Die Ermittlung der biologischen Aktivität gegen die drei proteolytischen Untereinheiten erfolgte durch Inkubation des mit Inhibitor vorbehandelten Proteasoms mit fluorogenen Substraten mit hoher Affinität für eine bestimmte Untereinheit (Suc-LLVY-AMC für CT-L, Z-LLE-AMC für C-L, Bz-VGR-AMC für T-L) und anschließende Quantifizierung der Menge des proteolytisch abgespaltenen AMC (7-Amino-4-methylcumarin). [111,113,115,118] einen Isopropylrest an C5 trägt, durch eine Totalsynthese zugänglich.…”