Solubilization and Refolding of Inclusion Body Proteins

Heterologous Expression of Difficult to Produce Proteins in Bacterial Systems

“…Some proteins show a low solubility and are mainly produced in their aggregated version. In consequence, many solubilization strategies and a wide number of refolding parameters have been described for the isolation of soluble proteins from IBs [21]. Due to the extent of IB characterization in the last two decades, showing that IBs are protein aggregates formed (at least partially) by correctly folded and fully active recombinant proteins [22], non-denaturing solubilization protocols have been recently developed [23,24].…”

Construção e avaliação de uma proteína de fusão recombinante de L-asparaginase e Arginase I

“…Após o isolamento, os CIs devem passar por uma etapa de solubilização. Para proteínas contendo múltiplos resíduos de cisteína, β-mercaptoetanol ou ditiotreitol (DTT) deverão ser adicionados as soluções com agentes de solubilização e nos tampões das etapas posteriores, isso para reduzir ligações dissulfeto incorretas (SINGH et al, 2015).…”

“…Nessa mesma posição dos géis (linha 6) pode se observar uma menor presença de bandas com baixa intensidade, indicando menor conteúdo de proteínas contaminantes e impurezas, o que pode ser atribuído à série de lavagens efetuadas, além do uso de baixa concentração de Triton X-100. Cabe destacar o papel do Triton X-100 na remoção dessas impurezas, que na literatura se reporta sua contribuição na diminuição da concentração de contaminantes tais como proteínas de membrana, lipopolissacarídeos (LPS), endotoxinas e DNA/RNAs da célula hospedeira (SINGH et al, 2015). A remoção das mencionadas impurezas é um passo importante antes da etapa de solubilização e renaturação dos agregados, já que além de diminuir etapas subsequentes de purificação, impacta na qualidade final do produto.…”

“…Mesmo que a triagem dos tampões de redobramento e promotores de desagregação proteica tenha se mostrado satisfatória para otimização do método de renaturação por diluição da proteína, outros tipos de métodos para redobramento, como alta pressão hidrostática ou redobramento e purificação simultâneos em coluna cromatográfica (revisões em: SINGH et al, 2015;SINGHVI et al, 2019) deveriam ser testados, a fim de estudar o real efeito e influência do método sobre a recuperação de atividade e eficácia em desagregação e renaturação, independentemente da proteína estudada.…”

“…Durante o processo de desagregação a estrutura da agua é alterada, provendo as condições para que moléculas hidrofóbicas dessas estruturas nativas e promover processos de re-enovelamento da proteína ao mesmo tempo que é solubilizada. Na maioria dos casos, essa estratégia não é efetiva, mesmo nesse tipo de CIs, pelo qual devem ser usadas condições de desnaturação muito mais fortes (revisões em:SINGH et al, 2015; SINGHVI et al, 2019).…”