Soluble Expression, Protein Purification and Quality Control of Recombinant Porcine Interferon-α

Abstract

Herein, we reported an Escherichia coli-based expression and purification method of recombinant porcine interferon alpha (rPoIFN-α). PoIFN-α coding sequence was cloned into pMD18-T vector and then subcloned into pET-32a (+) vector using standard recombinant DNA techniques and the resulting plasmid was transformed into BL21(DE3) competent cells. After induction with isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG), rPoIFN-α was purified from the supernatant of the bacteria lysate using a simple two-step chromatography process consisting of a Ni 2+ affinity chromatography and a DEAE anion exchange chromatography. rPoIFN-α was purified to >95% homogeneity with a yield of 48 mg/L of culture. It has isoelectic point of 6.09 and bacterial endotoxin was less than 1 EU/mg. N-terminal amino acid sequence and the peptide map digested by trypsin provided additional evidence for the authenticity of rPoIFN-α. The biological activity of rPoIFN-α was 1.1×10 6 IU/ mL in HEp-2/ Vesicular Stomatitis Virus (VSV) titration system and its specific activity reached to 1.0×10 6 IU/mg. In conclusion, we obtained high-level expression of a soluble form of bioactive rPoIFN-α by using pET-32a (+) prokaryotic expression system. Keywords: Soluble expression, Protein purification, Quality control, Porcine interferon-α, Vesicular Stomatitis Virus (VSV) Rekombinant Domuz İnterferon-α'nın Çözünür Ekspresyonu, Protein Saflaştırması ve Kalite Kontrolü ÖzetBu sunuda rekombinant domuz interferon alfa (rPoIFN-α)'nın Escherichia coli-temelli ekspresyonu ve saflaştırma metodu rapor edilmiştir. PoIFN-α kodlayan sekansı pMD18-T vektör içine klonlandı ve sonrasında standart rekombinant DNA teknikleri kullanılarak pET-32a (+) vektör içine subklonlandı ve elde edilen plazmid BL21(DE3) kompetan hücreler içine nakledildi. İzopropil-β-D-1-tiogalaktopiyranosid (IPTG) ile uyarmanın ardından rPoIFN-α, bakteri lizatının süpernatantından basit iki basamaklı kromatografi işlemi (Ni 2+ affinite kromatografi ve DEAE anyon değişim kromatografi) kullanılarak saflaştırıldı. rPoIFN-α 48 mg/L kültür oluşumu ve >95% homojenite ile saflaştırıldı. Ürün 6.09 izoelektrik puanına sahip olup bakteriyal endotoksin 1 EU/mg'dan daha azdý. N-ucu amino asit sekansý ve tripsin ile oluþturulan peptit haritasý rPoIFN-α'nın özgünlüğü hakkında ilave kanýt saðladý. rPoIFN-α'nın biyolojik aktivitesi HEp-2/ Vesicular Stomatitis Virus (VSV) titrasyon sisteminde 1.1×10 6 IU/mL olarak tespit edilirken spesifik aktivitesi 1.0×10 6 IU/mg'a ulaştı. Sonuç olarak, pET-32a (+) prokaryotik ekspresyon sistemi kullanılarak biyoaktif rPoIFN-α'nın çözünür formunun yüksek derecede ekspresyonu sağlandı.