O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito isolado ou combinado da bovicina HC5 e alfa-ácidos de lúpulo (lactoStab) na fermentação ruminal in vitro utilizando líquido ruminal de vacas leiteiras e incubado com substrato à base de fubá e silagem de milho. Após 48 h de incubação foi realizada a análise da digestibilidade in vitro da matéria seca (DIVMS) e o pH ruminal. Também foram coletadas alíquotas após 0 h, 6 h, 9 h, 18 h, 24 h e 48 h de incubação para análises de produção de gás, concentração de nitrogênio amoniacal, proteína solúvel e proteína microbiana. O perfil de ácidos orgânicos voláteis foi analisado nos tempos 0 h, 6 h, 9 h e 24 h de incubação. As concentrações estabelecidas para bovicina HC5 (B) e lactoStab (L), isoladamente ou combinados, foram de 5 µM e 100 ppm, respectivamente. A adição dos antimicrobianos em substrato à base de fubá e silagem de milho não afetou a digestibilidade in vitro da matéria seca (P>0,05) e não influenciou a produção de gás (P>0,05). No entanto, a bovicina HC5 diminuiu (P<0,05) o acúmulo de amônia (Δ amônia) em relação ao controle. Os tratamentos com lactoStab e a combinação B+L apresentaram menor concentração total de proteína solúvel (P<0,05), enquanto o oposto foi observado para o tratamento com bovicina HC5 quando comparado ao controle (P<0,05). Bovicina HC5 aumentou a produção de proteína microbiana (P<0,05). Além disso, os antimicrobianos avaliados aumentaram a concentração total de ácidos orgânicos voláteis (AOV) (P<0,05) em relação ao controle. Tanto a adição isolada da bovicina HC5, quanto a aplicação combinada (B+L) aumentaram a produção de propionato (P<0,05). Não houve efeito na produção de acetato, independentemente do antimicrobiano avaliado (P>0,05). No entanto, o grupo da combinação B+L reduziu a relação A:P (P<0,05). Os antimicrobianos testados aumentaram a concentração total de AOV e não afetaram os demais paramentos da fermentação ruminal in vitro. A bovicina HC5 afetou positivamente a fermentação ruminal de proteína, promovendo aumento da proteína microbiana e menor Δ amônia. A concentração de proteína solúvel e propionato foi menor no tratamento com lactoStab. Os resultados sugerem que bovicina HC5 pode potencializar o efeito do lactoStab, com consequente aumento da produção de propionato e redução da relação acetato/propionato. Palavras-chave: Aditivo alimentar. Peptídeo antimicrobiano. Desaminação.