Struktur und Funktion einer RNA‐lesenden thermostabilen DNA‐Polymerase

Abstract

Die hohe Substratspezifität von DNA-abhängigen DNA-Polymerasen ist einerseits für die Stabilität des Genoms, andererseits auch für viele biotechnologische Anwendungen essentiell.[1] Speziell in vivo ist die Diskriminierung zwischen Ribo-und Desoxyribonukleotiden sowie zwischen RNA und DNA wichtig, da die Anzahl der Ribosebausteine die der Desoxyribosebausteine bei weitem übersteigt. Während der Selektionsmechanismus beim Einbau von Nukleotiden durch DNA-und RNA-Polymerasen [2] schon intensiv studiert wurde, ist darüber hinaus wenig bekannt, wie DNA-abhän-gige DNA-Polymerasen zwischen den verschiedenen Nukleinsäuretemplaten (DNA zu RNA) unterscheiden. Einige virale DNA-Polymerasen (z. B. Reverse Transkriptasen) sind in der Lage, DNA und RNA als Templat für die Nukleinsäuresynthese zu verwenden. Die Analyse der Kristallstrukturen dieser Enzyme, im Komplex mit RNA oder DNA als Templat, hat maßgeblich zum Verständnis dieses Prozesses [3] beigetragen. Für DNA-abhängige DNA-Polymerasen, die RNA-Template nur schlecht prozessieren kçnnen, fehlt es allerdings an vergleichbaren strukturellen Daten, was vermutlich durch die Entstehung instabiler Komplexe und einer daraus resultierenden strukturellen Heterogenität, die die Kristallisation erschweren, begründet werden kann.Die Kristallstrukturanalyse der KlenTaq-DNA-Polymerase, einer verkürzten Form der DNA-Polymerase aus Thermus aquaticus, hat erheblich zum Verständnis beigetragen, wie DNA-Polymerasen das natürliche Substrat erkennen [4] sowie abasische Stellen [5] und nicht-natürliche Nukleotide prozessieren.[ [6] In diesem Screening wurden zwei Varianten, RT-KTq 1 und RT-KTq 2, identifiziert und aufgrund ihrer signifikant erhçhten Reverse-Transkriptase-Aktivität gegenüber den parentalen Enzymen und einer minimalen Anzahl an Mutationen weiter charakterisiert. RT-KTq 1 besitzt drei Mutationen (S515R, I638F und M747K), wohingegen RT-KTq 2 zusätzlich zu den Mutationen von RT-KTq 1 eine weitere Mutation aufweist (L459M, Abbildung 1 a). Für Vergleichsstudien wurde über zielgerichtete Mutagenese eine Variante generiert, die alle sieben Mutationen aufweist (KTq M1/M747K). Der KTq-Wildtyp, die parentalen Enzyme M1 und M747K, KTq M1/M747K und RT-KTq 1 und 2 wurden exprimiert, gereinigt, auf die gleiche Proteinkonzentration eingestellt (Abbildung S1) und weiter charakterisiert.

Reverse Transcriptases: From Discovery and Applications to Xenobiology

“…These elevated error rates should then be detected as N 6 ‐methylation marks by Next Generation Sequencing (NGS) (see Figure 4). To achieve this goal, the previously generated RT‐KTq library from Aschenbrenner and Marx [44] was used and expanded by new DNA polymerase mutants whose mutation sites are located in proximity to the nascent base pair in the closed crystal structure of the RT‐KTq 2 [40] . Screening was performed with a single nucleotide primer extension setup where capillary electrophoresis (CE) was employed to guarantee quick and efficient incorporation monitoring.…”

“…In this way, product formation which is methyl-independent could be monitored and used to normalize the methyl-dependent RT-PCR results. This assay was used to screen newly generated RT-KTq 2 variants which were designed according to the findings from the crystal structure from Blatter et al [40,44] The best discrimination effect was seen with the variant RT-KTq V669L (see Figure 1) which was finally able to detect 2'-O-methylation sites on human 18S rRNA even in picomolar concentration ranges. The authors demonstrated that this experimental setup is also suitable to quantify five known methylation sites of human 18S rRNA from different cell types and identified position A99 to be less methylated in colon cancer cells.…”

“…Generally, Raghunathan and Marx found a new set of mutation sites that successfully elevates reverse transcription activity and can be used for further engineering trials in future. Particularly exciting would be a direct comparison of the RT-KTq 2 enzyme developed by N. Blatter et al [40] and the KTq Mut_RT variant from Raghunathan and Marx. [49] One can think of a new mutant library where mutation sites of both enzymes are combined to get novel KTq DNA polymerase variants with both a different mutation level and amino acid composition.…”

“…In this way, product formation which is methyl‐independent could be monitored and used to normalize the methyl‐dependent RT‐PCR results. This assay was used to screen newly generated RT‐KTq 2 variants which were designed according to the findings from the crystal structure from Blatter et al [40,44] . The best discrimination effect was seen with the variant RT‐KTq V669L (see Figure 1) which was finally able to detect 2’‐ O ‐methylation sites on human 18S rRNA even in picomolar concentration ranges.…”

2016 EMBO Chemical Biology Conference

“…Next, Andreas Marx discussed the evolution of enzymes with new functions uch as DNA polymerasesw ith reverse-transcriptase activity. [10] Innovative chemical-biology approaches for preparing proteins with site-specific post-translational modifications (PTMs) such as such poly(ADP)ribosylation were also discussed, together with methods for their imaging in cells. [11] Sophisticateds emisynthesis strategies have been developed for the preparation of selectively modified chromatin, forming the basis of ap owerful toolkit for addressing the histone code hypothesis.…”