Successful experience with axenic isolation of Leishmania infantum in culture medium enriched with equine blood

Abstract

O objetivo do estudo foi demonstrar a experiência exitosa no isolamento axênico de promastigotas de Leishmania infantum (L. infantum) em cultura, utilizando meios de agar base enriquecido com sangue desfibrinado de equino (SDE). No estudo foram utilizadas amostras de aspirado de linfonodo e fragmentos de baço, fígado e linfonodo, de cão infectado com a doença. Os meios de culturas empregados para o isolamento do parasito foram bifásico (sólido e líquido) e monofásico (líquido). Para a fase bifásica utilizou-se o Agar Sangue Base (BAB) e Neal Novy Nicolle (NNN), ambos enriquecidos com SDE, que após solidificação adicionou-se caldo de Brain Heart Infusion (BHI). Para fase monofásica utilizou-se o Meio 199 (M199) suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB). As amostras foram semeadas em duplicata, utilizando os protocolos: (NNN+SDE), (BAB+SDE) e (M199+SFB), mantidas em estufa por demanda bioquímica de oxigênio à 25ºC por 15 dias. Leituras microscópicas foram realizadas diariamente para acompanhamento da fase primária de crescimento do parasito. Após isolamento primário, as amostras foram seriadas e diluídas com concentração final de 1x106 parasitos/mL, para avaliação da curva de crescimento. O estudo demonstrou que nos tubos contendo meios bifásicos NNN e BAB enriquecido com SDE, o crescimento primário de parasito foi de 72 horas, enquanto para os tubos suplementados com SFB foi de 96 horas. Em relação à curva de crescimento observou-se que durante a fase exponencial, as amostras contendo fragmentos de baço, fígado e linfonodo enriquecidos SDE obtiveram maiores concentrações de promastigotas, quando comparado às amostras suplementadas com SFB, sendo 189x106 e 128x106 parasitos/mL, respectivamente. Na análise estatística, houve diferença significativa (p<0,05) do percentual de número de promastigotas isoladas em meio enriquecido com SDE, quando comparado ao meio com SFB. Os tubos primários mantiveram-se viáveis em todo o período de estudo, mesmo após repiques utilizados para manutenção do parasito. A técnica tradicional de isolamento do parasito em meio de cultura mais comumente utilizada é em agar base enriquecido com sangue de coelho, no entanto, dificuldades operacionais na aquisição deste enriquecedor tem impulsionado a busca por outras fontes de suplementação proteica, para cultivo de L. infantum. O estudo revela que a utilização de SDE, como meio enriquecedor alternativo de cultivo para o isolamento primário de L. infantum foi viável para ser usado em nossa rotina laboratorial.

Evaluation of fetal bovine serum as a source of enrichment in synthetic culture medium for the isolation of Mycobacterium bovis

“…O enriquecimento nos meios de cultura tem sido usado por mais de 120 anos. Ele consiste em incubar uma amostra em um meio que estimula o crescimento do organismo de interesse (Bertollo & Montanha, 2022;Green, 2021), principalmente quando há um número pequeno de bactérias, que podem ser perdidas. O enriquecimento provê nutrientes, elementos essenciais e condições ambientais para o crescimento da bactéria (Bonnet et al, 2020).…”