Synthesis and Biological Activity of Photoactivatable N-Ras Peptides and Proteins

Abstract

A modular strategy for the assembly of farnesylated N-Ras heptapeptides carrying a photoactivatable benzophenone (BP) group within the lipid residue is described. This strategy is based on the fragment condensation of a N-terminal hexapeptide synthesized on the solid support with a cysteine methyl ester which is modified with different farnesyl analogues, incorporating the photophor. At the N-terminus of the peptides different functional groups can be attached, e.g., biotin for product enrichment and detection after photoactivation or a maleimido (MIC) linker, allowing for the coupling to proteins carrying a C-terminal free cysteine. Using this strategy, 24 peptides were synthesized, incorporating farnesyl analogues with four different chain lengths. Two of these photoactivatable conjugates were ligated to oncogenic human N-RasG12V Delta 181. A cellular transformation assay revealed that the semisynthetic proteins retain their biological activity despite the photolabel. The first photolabeling experiments with a geranyl-BP-labeled N-Ras construct and the farnesyl-sensitive guanine nucleotide exchange factor hSos1 indicate that this photoaffinity labeling system can be particularly useful for studying protein-protein interactions, e.g., the participation of the farnesyl group in Ras signaling, which is still discussed with controversy.

Lipidated Ras and Rab Peptides and Proteins—Synthesis, Structure, and Function

“…These approaches have been used quite frequently and are especially successful for prenylated peptides as has been shown by the notable contribution of Naider and co-workers, [19,35] Gelb and co-workers, [36][37][38] Poulter and co-workers, [39] and Waldmann and co-workers. [40][41][42][43] A typical example of a synthesis of such a prenylated peptide is given in Scheme 3. [41] The Cterminal N-Ras peptide features a Cterminal lipidated cysteine, which, in solution, is coupled to the C-terminal part of the peptide that has been assembled on a solid support.…”

“…[40][41][42][43] A typical example of a synthesis of such a prenylated peptide is given in Scheme 3. [41] The Cterminal N-Ras peptide features a Cterminal lipidated cysteine, which, in solution, is coupled to the C-terminal part of the peptide that has been assembled on a solid support. The N terminus of the peptide is functionalized with the MIC group for ligation to a cystein on the Ras-GTPase.…”

Strukturmodell des membrangebundenen C‐Terminus des humanen lipidmodifizierten N‐Ras‐Proteins

“…[9] Die N-Ras-Lipoproteine wurden nach dem bereits beschriebenen Verfahren hergestellt. [11] Strukturberechnung: Neben den zehn Torsionswinkeln, die für die drei Strukturmodelle durch TALOS bestimmt wurden, deutet die Differenz in der chemischen Verschiebung von Cb und Cg beim Prolin 185 auf eine trans-Anordnung der Peptidbindung zwischen Leu 184 und Pro 185 hin. [17] Im Ganzen wurden elf Strukturkonstanten für die Rückgratkonformation bestimmt und in der Berechnung mithilfe des Programms DYNAMO 3.1 [22] …”

“…Beide Varianten wurden jeweils mit einer SHexadecyl-(HD) und einer S-Farnesylkette (Far) an den beiden Cys-Resten versehen. [11] Das Protein wurde in deuterierte DMPC-Membranen rekonstituiert und durch MAS-NMR-Spektroskopie untersucht. In Abbildung 1 sind die relevanten Bereiche der 1 H-13 C-(a, b) [12] und 13 C-13 C-Korrelationsspektren (c, d) [13] [14] Mithilfe des Datenbankprogramms TALOS können aus den chemischen Verschiebungen die Torsionswinkel des Proteinrückgrats bestimmt werden.…”

Chemoselektive Ligations‐ und Modifikationsstrategien für Peptide und Proteine

“…[250] MIC-Bausteine 180 ("MIC-OH") können durch SPPS in einfacher Weise und sogar in empfindliche lipidierte Peptide [251] eingeführt oder mit photoaktivierbaren Gruppen wie Benzophenon kombiniert werden. [252] Obwohl die Ortsspezifität dieser Reaktion durch andere Cysteine im Molekül potenziell beeinträchtigt wird, hat diese Reaktion breite Anwendung [253] für selektive Funktionalisierungen von Proteinen gefunden, die nur ein solvensexponiertes Cys aufweisen. Ein Beispiel ist die Synthese der Ras-Proteine 181, die eine spezifische Proteinmodifikation tragen (Schema 28 B) (siehe die ausführliche Diskussion dieses Beispiels in Abschnitt 6.3).…”