O ácido úsnico (AU) é um metabólito secundário de líquens que tem demonstrado potenciais efeitos farmacológicos, tais como atividade antimicrobiana, antiviral, antiproliferativa e anti-inflamatória. O colágeno, por sua vez, é um dos biomateriais mais utilizados visando o desenvolvimento de sistema de liberação de fármacos. Sendo assim, o objetivo deste estudo foi desenvolver e validar um método analítico por espectrofotometria na região do ultravioleta (UV) para determinação de concentrações de AU em membranas de colágeno. Os parâmetros de validação foram determinados de acordo com a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA). A especificidade revelou que os excipientes na formulação não interferiram na análise. A linearidade nas concentrações de 2-10 µg/mL apresentou um coeficiente de correlação de 0,9994. O método mostrou excelente repetibilidade (desvio-padrão relativo < 1,0%). A precisão revelou uma recuperação média percentual de 100,43%. O método foi robusto para a variação de temperatura e solvente. Os limites de detecção e de quantificação foram 0,109 e 0,364 g/mL, respectivamente. A taxa total de recuperação das membranas analisados apresentaram valores entre 100,4 e 83,2%.Palavras-chave: ácido úsnico, membranas de colágeno, espectrofotometria UV The usnic acid (UA) is a secondary metabolite of lichen that has shown potential pharmacological effects such as antimicrobial, antiviral, antiproliferative and anti-inflammatory activities. Collagen is one of the most useful biomaterials with various applications as drug delivery systems. The aim of this study was to develop and validate a quantitative UV spectrophotometric method for the determination of UA levels in collagen membranes. The validation parameters were assessed according to the Brazilian Health Surveillance Agency (ANVISA). The specificity revealed that the excipients in the formulation did not interfere with the analysis. The linearity in the range of 2-10 μg/mL presented a correlation coefficient of 0.9994. The method showed excellent repeatability (Relative Standard Deviation (RSD) < 1.0%). The accuracy revealed a mean percentage recovery of 100.43%. The method was robust for the variation of temperature and solvent. The detection and quantization limits were found at 0.109 and 0.364 µg/mL. The total rate recovery from the analyzed membranes showed values between 100.4 and 83.2%.