The Effect of Endoplasmic Reticulum Stress Activator-Tunicamycin on HEK293 Cells

Abstract

ÖZ ABSTRACT ORİJİNAL ARAŞTIRMA Cite this article as: Kalkan MA, Vural B, Kömürcü Bayrak E. The Effect of Endoplasmic Reticulum Stress Activator-Tunicamycin on HEK293 Cells. Experimed 2018; 8(3): 71-8.Amaç: Endoplazmik Retikulum (ER), protein katlanması ve işlenmesi yanı sıra Ca +2 ve glikojen deposu ve hücre membran lipidlerinin biyogenezi gibi fonksiyonlara sahiptir. Hipoksi, viral enfeksiyonlar, yanlış protein katlanmaları, protein birikimleri ve bazı kimyasallar hücrede, ER stresine sebep olarak katlanmamış protein yanıtı (UPR) sistemlerini devreye sokmaktadır. Bu kimyasallardan biri olan Tunikamisin, asparajin-bağlı glikoproteinlerin sentezinin ilk adımında görev alan GPT (GlcNAc fosfotransferaz) enzimini inhibe ederek hücrede ER stresine sebep olan bir antibiyotiktir. Bu çalışmada, ER stresini in vitro araştırmak için en uygun deney şartlarının belirlenmesi amaçlanmıştır.Gereç ve Yöntem: HEK293 hücre hattı uygun kültür koşullarında çoğaltılarak 5 farklı dozda (0,5-1-2-5 ve 10 µg/mL), 12 saatlik Tunikamisin uygulanmıştır. 1-2-4-8 ve 12 saatlik sürelerle ışık mikroskobunda morfolojik değerlendirilmeleri yapılmıştır. Normal HEK293 hücreleri ile 0,5 ve 1 µg/mL Tunikamisin uygulanan hücrelerden total RNA izolasyonu ve cDNA sentezi yapılmıştır. Tunikamisin uygulamasının ER stres açısından değerlendirilmesi için UPR sisteminden seçilen CHOP, BiP, GADD34, ATF4, EDEM1, ASK1, XBP1 (spliced, unspliced ve total), TRAF2, HERP, PDIA4 genlerinin qRT-PCR yöntemi ile gen ekspresyonları normal hücrelere göre kıyaslanmıştır. Bulgular: Tunikamisin uygulamasından 1-2-4-8 ve 12 saatlik ışık mikroskobunda HEK293 hücrelerinin morfolojilerinin sadece 0,5 ve 1 µg/ mL konsantrasyonlarda korunduğu gözlenmiştir. Diğer dozlarda ise daha ilk saatten hücrelerin morfolojik yapılarının bozulduğu gözlenmiştir. qRT-PCR yöntemi ile UPR-ilişkili genlerden BiP, ASK1, PDIA4, s-x-BP1, us-XBP1, t-XBP1, HERP ve CHOP rölatif kantitasyon değerlerinde Tunikamisin uygulanmış HEK293 hücrelerin normal hücrelere göre anlamlı bir artış saptanmıştır. ASK1 ile aynı yolaktan olmasına rağmen TRAF2 geni rölatif kantitasyon değerinde azalma gözlenmiştir. Sonuç: HEK293 hücrelerinde ER stresinin oluşturulabilmesinde 0.5 ve 1 µg/mL'lik Tunikamisin uygulaması uygun bulunmuştur. Daha yüksek dozların HEK293 hücrelerini apoptoza yönlendirdiği düşünülmektedir.Anahtar Kelimeler: Endoplazmik retikulum stresi, tunikamisin, HEK293 hücreleri, katlanmamış protein yanıtı Objective: Among the functions of the Endoplasmic Reticulum (ER) are many different reactions that include the regulation of protein folding and modifications in the lumen, as well as the use of Ca +2 and glycogen storage, the biogenesis of cell membrane lipids. ER homeostasis becomes unbalanced and is recognized as ER stress by the cell. It triggers Unfolded Protein Responce (UPR) systems. Hypoxia, viral infections, unfolded protein accumulation, and some chemicals cause ER stress. Among the chemicals, tunicamycin is an antibiotic known to induce ER stress in the cell by inhibiting the enzyme GlcNAc phosphotran...