The sidedness of the COOH terminus of the acetylcholine receptor δ subunit

DiPaola, Mario; Czajkowski, Cynthia; Karlin, Arthur

doi:10.1016/s0021-9258(19)84851-2

Cited by 68 publications

(21 citation statements)

References 31 publications

Supporting

Mentioning

Contrasting

Unclassified

Order By: Relevance

“…Our observation that the carboxy termini of the a and S subunits are located on the lumenal side ofthe membrane are supported by previous experiments demonstrating that the AChR oligomers of Torpedo are linked as dimers via an extracellular disulfide bond between cysteine residues near the carboxy terminus ofneighboring S subunits (16,23,37) . Earlier reports based on immunocytochemical localization (47,48,56) placed the carboxy terminus on the cytoplasmic side of the membrane.…”

Section: Discussionsupporting

confidence: 86%

“…An amphipathic transmembrane domain between M3 and M4 (designated MA) was proposed on the basis of primary sequence analysis (17,22), placing the carboxy terminus on the cytoplasmic side of the membrane. Epitope mapping experiments support models with a pair of transmembrane domains in the region before Ml (12,44,48), and other immunochemical and biochemical experiments support models with zero (48), one (16,37), or two (17,22,56) transmembrane domains beyond M3. Thus, models with three to seven transmembrane domains can be constructed .…”

mentioning

confidence: 70%

See 1 more Smart Citation

Expression of fusion proteins of the nicotinic acetylcholine receptor from mammalian muscle identifies the membrane-spanning regions in the alpha and delta subunits.

Chavez

Hall

1992

The Journal of Cell Biology

View full text Add to dashboard Cite

Abstract. We have investigated the topology of the a and S subunits of the nicotinic acetylcholine receptor (AChR) from mammalian muscle synthesized in an in vitro translation system supplemented with dog pancreatic microsomes. Fusion proteins were expressed in which a carboxy-terminal fragment of bovine prolactin was attached downstream of each of the major putative transmembrane domains, Ml-M4 and MA, in the AChR subunits. The orientation of the prolactin domain relative to the microsomal membrane was then determined for each protein by a proteolysis protection assay. Since the prolactin domain contains no information which either directs or prevents its translocation, its trans-HE nicotinic acetylcholine receptor (AChR),' which is found at the neuromuscular junction in vertebrate skeletal muscle and at the endplates of electric organs, is a pentameric complex composed offour glycoprotein subunits in an a28,yb stoichiometry (10). The subunits are arranged pseudosymmetrically around a central ion channel (40,53) . A comparison of the primary sequences ofthe subunits of the AChR reveals a high degree of homology both within and across species boundaries (52) . The AChR is the best-studied member of a super-family of ligand-gated ion channels which includes the GABAA, glycine, and neuronal nicotinic acetylcholine receptors (20,43,51) . All of these channels are hetero-oligomers whose subunits are highly homologous, suggesting that they are derived from a common evolutionary precursor.The subunits of the AChR and related channels also share a common domain structure . Hydropathic analysis ofthe primary sequence reveals five regions of high hydrophobicity comprised of an amino-terminal signal sequence (1, 2, 4) and four regions of sufficient length to form (Y-helical transmembrane domains (Ml through M4) (11,15,41). This domain pattern has led to a structural model of the AChR subunits in which the amino and carboxy termini are on the extracellular side ofthe membrane separated by four transmembrane When subunit-prolactin fusion proteins with the prolactin domain fused after either M2 or M4 were tested, prolactin-immunoreactive peptides that were larger than the prolactin domain itself were recovered . No prolactin-immunoreactive peptides were recovered after proteolysis of fusion proteins containing prolactin fused after Ml, M3, or MA. These results support a model of AChR subunit topology in which Ml-M4, but not MA, are transmembrane domains and the carboxy terminus is extracellular. domains (Ml-M4) and a long cytoplasmic loop between M3 and M4 (see Fig. 1).Although this model is commonly accepted, experiments on the topological arrangement of the AChR subunits have yielded conflicting results, leading to several alternative models of subunit structure . An amphipathic transmembrane domain between M3 and M4 (designated MA) was proposed on the basis of primary sequence analysis (17,22), placing the carboxy terminus on the cytoplasmic side of the membrane. Epitope mapping experiments support models with a pair of t...

show abstract

Section: Discussionsupporting

confidence: 86%

mentioning

confidence: 70%

Expression of fusion proteins of the nicotinic acetylcholine receptor from mammalian muscle identifies the membrane-spanning regions in the alpha and delta subunits.

Chavez

Hall

1992

The Journal of Cell Biology

View full text Add to dashboard Cite

show abstract

“…The Torpedo AChR is a multi-subunit integral membrane glycoprotein with four homologous polypeptide subunits, designated a, ,B, y, and 6, with a relative stoichiometric ratio of a2g'A (for recent reviews see Stroud et al, 1990;Galzi et al, 1991;Lingle et al, 1992;Pradier and McNamee, 1992;Unwin, 1993a). A generally accepted model for the topology of all subunits assumes that the transmembrane domains of each subunit are composed of four hydrophobic domains (Ml, M2, M3, M4) (Claudio et al, 1983;Devillers-Thiery et al, 1983;Noda et al, 1983), and that both the N-and C-terminals are located on the extracellular side (DiPaola et al, 1989; see Fig. 1).…”

Section: Introductionmentioning

confidence: 99%

Mutations in the M4 domain of Torpedo californica acetylcholine receptor dramatically alter ion channel function

Lee

Lasalde

et al. 1994

Biophysical Journal

103

View full text Add to dashboard Cite

Site-directed mutagenesis was used to mutate alpha Cys418 and beta Cys447 in the M4 domain of Torpedo californica acetylcholine receptor expressed in Xenopus laevis oocytes. The M4 region is a transmembrane domain thought to be located at the lipid-protein interface. By whole-cell voltage clamp analysis, mutation of both alpha subunits to alpha Trp418 increased maximal channel activity approximately threefold, increased the desensitization rate compared with wild-type receptor, and shifted the EC50 for acetylcholine from 32 microM to 13 microM. Patch measurements of single-channel currents revealed that the alpha Trp418 increased channel open times approximately 28-fold at 13 degrees C with no effect on channel conductance. All of our measured functional changes in the alpha Trp418 mutant are consistent with a simple kinetic model of the acetylcholine receptor in which only the channel closing rate is altered by the mutation. Our results show that changes in protein structure at the putative lipid-protein interface can dramatically affect receptor function.

show abstract

“…Η ανάλυση του διαγράμματος υδροφοβικότητας της α υπομονάδας του Torpedo nAChR επιβεβαίωσε την αρχική πρόβλεψη για τη διαμεμβρανική τοπογραφία των διάφορων nAChR υπομονάδων (Noda et al 1983a, Devillers-Thiery et al 1983, Finer-Moore and Stroud 1984. Έτσι, κάθε nAChR υπομονάδα αποτελείται από τέσσερις διαμεμβρανικές υδρόφοβες περιοχές (Μ1-Μ4), μήκους ~15-20 αμινοξέα έκαστη, από μία αμινοτελική υδρόφιλη περιοχή μήκους ~210 αμινοξέων, από μία μικρή υδρόφιλη περιοχή μεταξύ των Μ3 και Μ4 περιοχών στην οποία εντοπίζονται και οι θέσεις φωσφορυλίωσης των nAChR υπομονάδων (Finer- Stroud 1984, Yee andHuganir, 1987) και από ένα υδρόφιλο καρβόξυ-τελικό άκρο μήκους ~4-28 αμινοξικών καταλοίπων (DiPaola et al 1989).…”

Section: πρωτοταγής δομή των Nachr υπομονάδωνunclassified

Έκφραση Και Δομική Μελέτη Τμημάτων Του Νικοτινικού Υποδοχέα Της Ακετυλοχολίνης

Ζουριδάκης¹

View full text Add to dashboard Cite

Οι νικοτινικοί υποδοχείς της ακετυλοχολίνης (nAChRs) ανήκουν στην υπερ-οικογένεια των πενταμερών ιοντικών καναλιών (LGICs), που περιλαμβάνει τους υποδοχείς σεροτονίνης (5-HT3), γλυκίνης (GlyR) και γ-αμινοβουτυρικού οξέος (GABAA, GABAB). Κάθε υπομονάδα του nAChR αποτελείται από μία αμινο-τελική εξωκυτταρική περιοχή (ΕΚΠ), στην οποία βρίσκεται η χαρακτηριστική Cys θηλιά της υπερ-οικογένειας, από τέσσερεις διαμεμβρανικές α-έλικες και από μία κυτταροπλασματική περιοχή. Οι nAChRs διακρίνονται σε μυϊκούς και νευρικούς. Οι μυϊκοί nAChRs βρίσκονται στα ηλεκτρικά όργανα ιχθύων Torpedo sp. και στις νευρομυϊκές συνάψεις σπονδυλωτών, όπου μεταβιβάζουν τις νευρικές ώσεις στους μείς. Σχηματίζουν ετεροπενταμερή με στοιχειομετρία υπομονάδων (α1)2β1γδ ή (α1)2β1εδ στα ενήλικα άτομα θηλαστικών, με δύο θέσεις πρόσδεσης χολινεργικών προσδετών μεταξύ των α1-ΕΚΠ και της γ(ε) και δ-ΕΚΠ. Στην α1-ΕΚΠ εδράζει επίσης η κύρια ανοσογόνος περιοχή (MIR), έναντι της οποίας κατευθύνονται αντι-nAChR αντισώματα στην περίπτωση της βαριάς μυασθένειας. Οι νευρικοί nAChRs βρίσκονται στο κεντρικό και περιφερικό νευρικό σύστημα, όπου διαβιβάζουν τις νευρικές ώσεις. Σχηματίζουν είτε ετεροπενταμερή, μεταξύ 2-3 α-υπομονάδων (υπότυποι α2-6) και 2-3 β-υπομονάδων (υπότυποι β2-4), ή ομοπενταμερή. Η α7 είναι η μόνη γνωστή υπομονάδα του νευρικού nAChR που σχηματίζει ομοπενταμερή μόρια στον άνθρωπο, με πέντε θέσεις πρόσδεσης χολινεργικών υποκαταστατών. Μέχρι στιγμής, έχουν πραγματοποιηθεί τέσσερα σημαντικά επιτεύγματα, όσον αφορά την κατανόηση της δομής των nAChRs: Α. Η λύση της δομής, με κρυσταλλογραφία ακτίνων-Χ, της ομόλογης προς τα ΕΚΠ τμήματα των α υπομονάδων του nAChR (25% αμινοξική ταύτιση με την α7), ομοπενταμερούς πρωτεΐνης δέσμευσης της ACh γαστεροπόδων (AChBP), καθώς και των δομών της με διάφορους χολινεργικούς προσδέτες. Προσεγγίστηκε έτσι για πρώτη φορά η διαμόρφωση των nAChR-θέσεων πρόσδεσης χολινεργικών υποκαταστατών. Β. Η λύση της δομής, με ηλεκτρονική μικροσκοπία, του Torpedo nAChR, η οποία αποκάλυψε την δευτεροταγή και τριτοταγή δομή του nAChR. Εντούτοις, λόγω της περιορισμένης ευκρίνειας (4 A), δεν αποκάλυψε τη συγκρότηση των θέσεων πρόσδεσης της ACh σε ατομικό επίπεδο. Γ. Η λύση της δομής σε υψηλή ευκρίνεια (1,94 A) του συμπλόκου της α1-ΕΚΠ επίμυος με τον nAChR- ανταγωνιστή α-μπουγκαροτοξίνη (α-bgtx). Η λυση αυτής της δομής αποκάλυψε σε ατομικό επίπεδο την MIR περιοχή, τις θηλιές Α, B και C της κυρίως πλευράς των θέσεων πρόσδεσης χολινεργικών προσδετών και τη χαρακτηριστική Cys θηλιά. Δεδομένου όμως, ότι η δομή της α1-ΕΚΠ αναπαριστά ένα μονομερές, η δομή μίας πλήρως διαμορφωμένης θέσης πρόσδεσης εξακολουθεί να απουσιάζει. Δ. Η λύση της δομής, με κρυσταλλογραφία ακτίνων-Χ, μίας προκαρυωτικής LGIC πρωτεΐνης (ELIC), η οποία θεωρείται μάλιστα πως αποτελεί τον πρόγονο όλων των ευκαρυωτικών LGICs, συμπεριλαμαβανομένου του nAChR, με την οποία αποκαλύφθηκε ο βασικός σκελετός της δομής των LGICs. Είναι φανερό, ότι παρόλα αυτά τα επιτεύγματα, απουσιάζει ακόμη η λύση της δομής ενός πενταμερούς nAChR. Η νευρική α7 υπομονάδα του nAChR είναι μία καλή υποψήφια για την επίτευξη αυτού του στόχου, αφού σχηματίζει πενταμερή in vivo. Επιπλέον, αυτή εμπλέκεται σε ένα μεγάλο αριθμό νευρικών παθήσεων (Alzheimer, Parkinson, επιληψία, σχιζοφρένεια, κλπ), και η λύση της δομής της θα οδηγήσει και στο σχεδιασμό θεραπευτικών προσεγγίσεων έναντι αυτών των ασθενειών. Μάλιστα, εφ’όσον στην α7- ΕΚΠ εδράζουν οι θέσεις πρόσδεσης χολινεργικών υποκαταστατών, είναι πιο ρεαλιστική η προσπάθεια κρυστάλλωσης αυτής της περιοχής αντί ολόκληρου του α7 nAChR, αφού οι εκτενείς υδρόφοβες διαμεμβρανικές περιοχές του τελευταίου περιορίζουν τη διαλυτότητά του. Στο παρελθόν είχαμε εκφράσει στο Εργαστήριό μας την ανθρώπινη α7-EKΠ αγρίου τύπου και ένα διπλό μετάλλαγμα αυτής, σε κύτταρα P. pastoris, με στόχο μελέτη της δομής τους. Τα μόρια αγρίου τύπου, βρέθηκαν όμως να είναι αρκετά υδρόφοβα, αφού εκφράσθηκαν ως συσσωματώματα πολύ υψηλού μοριακού βάρους (ΜΒ) και ως ολιγομερή μεγαλύτερα από πενταμερή. Τα μόρια του διπλού μεταλλάγματος, στα οποία ολόκληρη η Cys θηλιά του α7 nAChR αντικαταστάθηκε από την πιο υδρόφιλη Cys θηλιά της AChBP σε συνδυασμό με την μετάλλαξη Cys116Ser, εμφάνισαν μεν αυξημένη διαλυτότητα και ικανότητα πρόσδεσης α-bgtx, διατήρησαν όμως δε ένα σημαντικό βαθμό δημιουργίας συσσωματωμάτων υψηλού ΜΒ, οδηγώντας σε αποτυχείς προσπάθειες κρυστάλλωσής τους.

show abstract

The sidedness of the COOH terminus of the acetylcholine receptor δ subunit

Cited by 68 publications

References 31 publications

Expression of fusion proteins of the nicotinic acetylcholine receptor from mammalian muscle identifies the membrane-spanning regions in the alpha and delta subunits.

Expression of fusion proteins of the nicotinic acetylcholine receptor from mammalian muscle identifies the membrane-spanning regions in the alpha and delta subunits.

Mutations in the M4 domain of Torpedo californica acetylcholine receptor dramatically alter ion channel function

Έκφραση Και Δομική Μελέτη Τμημάτων Του Νικοτινικού Υποδοχέα Της Ακετυλοχολίνης

Contact Info

Product

Resources

About