Untersuchung von Quadruplex‐Konformationen der humanen Telomerensequenz mit Puls‐EPR

Abstract

Unter physiologischen Bedingungen nehmen Telomersequenzen unterschiedliche Quadruplexkonformationen ein, deren genaue Strukturen jedoch noch nicht zweifelsfrei bekannt sind. Doppelt spinmarkierte Oligonucleotide, die aus G‐reichen Telomerabschnitten bestehen, wurden synthetisiert und mithilfe von Puls‐EPR charakterisiert. In K+‐haltiger Lösung liegen die Propeller‐ und die Korbform als 1:1‐Mischung nebeneinander vor.

Intracellular Conformations of Human Telomeric Quadruplexes Studied by Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy

“…[1][2][3] Previous reports on in vitro DEER applications to study DNA deal mostly with samples of double helical structure. [11][12][13] The HT sequence d[AGGG(TTAGGG) 3 ] has been shown to exist in a 1:1 mixture of parallel propeller and antiparallel basket conformations (Figure 1 c,d) in K + solution. G-quadruplexes have been suspected to play important roles in cellular processes but their existence in cells is difficult to ascertain.…”

“…[4][5][6][7] Herein, for the first time, in-cell DEER was successfully employed to study the formation of human telomeric (HT) Gquadruplexes ( Figure 1) upon microinjection of an unfolded DNA sequence (Figure 1 b) into living cells. [13] Potassium is the most abundant metal ion in cells (with concentrations above 100 mm), and in addition, concentrations as small as 1 mm K + can determine the folding of a K + -dependent fold of the HT structure even in the presence of excess (100 mm) Na + . Indeed, induction of quadruplexes at the telomere was shown to interfere with telomere integrity and to inhibit proliferation of cancer cells.…”

“…[15,16] Herein, we describe long-range distance measurements on the HT DNA repeat utilizing in-cell DEER, which is an EPR technique for determining distance distributions between spin labels in cellulo by measuring their dipole-dipole interaction. [13] Details of synthesis, spin labeling, biophysical characterization, sample preparation, experiments, and data analysis are provided in the Supporting Information.Microinjection of doubly spin-labeled HT DNA into cells was carried out using a salt-free stock solution where no quadruplex folding was observed (see Supporting Information, Fig-Figure 1. [19] HT DNA was injected into the animal hemisphere cytoplasm of stage VI oocytes of Xenopus laevis (X. Laevis), where nucleus-like conditions preside.…”

Intrazelluläre Elektronenspinresonanz‐Spektroskopie

“…Diese ähnlich stabilen Konformationen können durchaus gleichzeitig vorliegen. 10) Auch in der Zelle bestätigen NMR-Daten koexistierende Konformationen, auch wenn eine Zuordnung bisher nicht gelang. 11) Für ein intrazelluläres ESR-Experiment wurde diese menschliche Telomer-Sequenz d[AGGG(TTAGGG) 3 ] ortsspezifisch spinmarkiert und ungefaltete Sequenz in lebende Zellen injiziert.…”

Sekundärstrukturanalyse von spinmarkierter RNA mit Puls‐EPR‐Spektroskopie

“…Die Koexistenz beider Konformationen wurde vor kurzem auch durch PELDORMessungen an spinmarkierter DNA bestätigt. [18] , einer besonders stabilen GGAA-Schlaufe und einem vier Nucleotide langen 3'-Überhang. In Gegenwart der vollständig komplementären (unmodifizierten) RNA 7 wird der Stamm aufgebrochen, und es bildet sich ein 20 Basenpaare langer Duplex.…”