Use of Adsorptive Transfer Stripping Voltammetry for Analyzing Variations of Cytosine Methylation in DNA

Abstract

The electrochemical behavior and thermal stability of double stranded oligonucleotides containing 5-methyl-cytosine and 7-deaza-guanosine as nucleotide analogues, as well as of Jurkat genomic DNAs methylated to different degree were studied by ACV and SWV and by thernal denaturation analysis. ACV and SWV combined with thermal denaturation analysis of the natural and modified oligonucleotides gave information regarding the presence of methylation and the concomitant conformational changes. ACV and SWV of Jurkat DNA mixtures methylated to different degrees revealed a decrease of the peak heights with increasing methylation, indicating an increase of structural rigidity, in agreement with the thermal denaturation data. These results verify the, possibly local, conformational changes introduced by DNA methylation. The results obtained in all cases were reproducible.

Recent Advances of Sensitive Electroanalytical Tools and Probes in the Study of DNA Structure

“…The electrochemical behaviour and thermal stability of double stranded oligonucleotides containing 5-methyl-cytosine and 7-deaza-guanosine as nucleotide analogues, as well as of Jurkat genomic DNAs methylated to different extent were studied by ACV (alternating current voltammetry) and SWV (square wave voltammetry) and results verify the possibly local, conformational changes introduced by DNA methylation [77]. An electrochemical procedure was developed for detecting DNA methylation status of the human p16Ink4a gene, a tumor suppressor gene.…”

Ανάπτυξη Ηλεκτροχημικών Βιοαισθητήρων Με Τη Χρήση Νανοϋλικών Και Εφαρμογή Τους Στη Βιοανάλυση

“…Όλες οι µέχρι σήµερα γνωστές µέθοδοι διερεύνησης της µεθυλίωσης είναι ως επί το πλείστον αρκετά περίπλοκες, χρονοβόρες και απαιτούν πολύπλοκους χειρισµούς του DNA [12], αυξάνοντας έτσι το κόστος και την πιθανότητα πειραµατικών σφαλµάτων [13]. Έτσι, η ανάπτυξη εναλλακτικών τεχνικών είναι σηµαντική και κύρια προτεραιότητα στη σηµερινή εποχή.…”

“…Πολαρογραφική αναγωγή των βάσεων των νουκλεϊκών οξέων (ΝΑs) παρατηρήθηκε σε σταγονικό ηλεκτρόδιο υδραργύρου (DΜΕ), γύρω στα µέσα του 20 ου αιώνα, µε την αδενίνη (Α) να είναι η πρώτη βάση που εµφανίστηκε ως ηλεκτροενεργή [13]. Περαιτέρω µελέτες αποκάλυψαν ότι η αδενίνη (Α) και η κυτοσίνη (C), µαζί µε τα νουκλεοσίδια και τα νουκλεοτίδιά τους, ανάγονται σε υδατικά µέσα σε όξινο pΗ, µε τα δυναµικά µισού-κύµατος (Ε 1/2 ) να είναι -1,33 V για την αδενίνη (Α) και -1,44 V για την κυτοσίνη (C) (vs SCE) σε pH 4,2 [14][15][16][17][18].…”

“…Αντίθετα, το ουδέτερο PNA έδειξε διαφορετική συµπεριφορά. Η προσρόφηση του ΡΝΑ στα ηλεκτρόδια άνθρακα χαρακτηρίζεται από αύξηση στο "πακετάρισµα" της επιφάνειας, κυρίως λόγω διαµοριακών επιφανειακών αλληλεπιδράσεων και από µια ασθενέστερη προσρόφηση σε θετικά δυναµικά, σε σύγκριση µε DNA[101].2.3 ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΤΗΣ ΜΕΘΥΛΙΩΣΗΣ ΤΟΥ DNAΌπως προαναφέρθηκε στο Κεφάλαιο 1 (παράγραφος 1.10) όλες οι µέχρι σήµερα γνωστές µέθοδοι διερεύνησης της µεθυλίωσης είναι στην πλειοψηφία τους αρκετά περίπλοκες, χρονοβόρες και απαιτούν πολύπλοκους χειρισµούς του DNA[12] αυξάνοντας έτσι το κόστος και την πιθανότητα πειραµατικών σφαλµάτων[13].του DNA και συνεπώς και σε επιγενετικές αναλύσεις, (όπως είναι η µεθυλίωση της κυτοσίνης (C)[102]. Η ηλεκτροχηµική ανίχνευση των βλαβών του DNA αντανακλά το γεγονός, ότι η ηλεκτροχηµική απόκριση του DNA εξαρτάται ισχυρά από τη δοµή του…”

“…Στο dsDNA η κορυφή CA είναι ευρύτερη και το ύψος της µικρότερο και υπάρχει, επίσης, µια µετατόπιση της κορυφής CA προς λιγότερο αρνητικά δυναµικά, σε σύγκριση µε το ssDNA. Η µείωση του ύψους της κορυφής, η οποία συνοδεύεται και από διεύρυνση του πλάτους της, θα µπορούσε να αποδοθεί στο γεγονός ότι στο dsDNA οι πρωτογενείς θέσεις αναγωγής τόσο της κυτοσίνης όσο και της αδενίνης , οι οποίες εντοπίζονται στους διπλούς δεσµούς Ν3 = C4 (στην κυτοσίνη) ή στους δεσµούς Ν1 = C6 (στην αδενίνη), είναι κρυµµένες στο εσωτερικό της διπλής έλικας του DNA και εποµένως η ισχυρή προσρόφηση του dsDNA µέσω των βάσεων επί της επιφανείας του ηλεκτροδίου παρεµποδίζεται[13,265].Η µεταβολή της έντασης των δύο κορυφών CA του ds και του ssDNA µε τη συχνότητα (Σχήµα 11.8) και µε την τετραγωνική ρίζα της συχνότητας (Σχήµα 11.9) Πίνακας 11.1 περιέχει τις συνθήκες µέτρησης. Όπως φαίνεται από το Σχήµα 11.10 , το ύψος της κορυφής CA αυξάνεται γραµµικά µε τη συγκέντρωση του ssDNA σε µια περιοχή από 1,00 έως 30,00 mg L -1 .…”