El ajonjolí es una planta importante en la producción de aceite comestible de alta calidad por su gran valor nutricional y terapéutico. La caracterización de accesiones es necesaria para la identificación de parentales con características de interés para la obtención de nuevos materiales genéticos. Se caracterizaron 160 accesiones de ajonjolí en el Centro de Investigación Nataima, municipio de El Espinal (Tolima), manejadas por el Sistema de Bancos de Germoplasma de la Nación para la Alimentación y la Agricultura, de las cuales, 136 fueron colectadas en 25 países. La caracterización incluyó 81 descriptores: 30 cuantitativos y 51 cualitativos. Se examinaron factores para datos mixtos y se generaron grupos homogéneos mediante análisis de conglomerados para cinco grupos de variables: planta y plántula, tallo y raíz, hoja, semilla y cápsula y flor. Se seleccionaron 25 variables discriminantes de las estructuras anteriores y se realizó un nuevo análisis de conglomerados que generó cinco agrupaciones principales influenciadas por las variables cualitativas: tipo y hábito de crecimiento, color del tallo, forma de la hoja, tipo de ramificación, color interno de la corola, posición de las cápsulas y color de la semilla, y cuantitativas: altura, longitud de internudos, número de ramas principales y secundarias, número de cápsulas por nudo, número de cápsulas por planta, número de semillas por cápsula, peso de 1000 semillas y rendimiento. La estructura de la agrupación no presentó influencia por la procedencia de las accesiones. Las accesiones TEHUANTEPEC SELEC, L-AJ-M-67, L-AJ-M-51, PARDO PELUDO, BLANCO CRIOLLO, NP-61, BACO, INSTITUTO 104, CHINO ROJO, R 198 y ACARIGUA presentaron características de interés que diferencian los grupos formados. Las variables discriminantes y los materiales identificados permiten la generación de variedades para futuros programas de mejoramiento en Colombia.