Validação de métodos laboratoriais aplicadas a análises com marcadores microssatélites

Abstract

Resumo -A troca de informação sobre biodiversidade e a utilização de recursos genéticos podem ser melhor realizadas se os laboratórios que geram as informações puderem demonstrar que seus resultados são confiáveis através de metodologias adequadas de validação. Para definir critérios que sirvam para demonstrar a confiabilidade de resultados em laboratórios onde são realizadas pesquisas com marcadores de DNA, foram analisados erros associados à quantificação de DNA em gel de agarose e à repetitividade e robustez da reação da polimerase em cadeia (PCR) utilizando primers baseados em marcadores microssatélites (SSR). O erro associado à quantificação de DNA foi menor quando 100 ng foram quantificadas, e aumentou para quantidades de DNA maiores, com a tendência de subestimar sua quantidade. O limite de quantificação, entendido como as menores diferenças de quantidade de DNA que o método detecta, variou expressivamente com pequena variação da quantidade de DNA. A incerteza associada ao PCR foi estimada por sua repetitividade, que mostrou-se sensível à quantidade de DNA da reação. A baixa robustez da PCR quanto à quantidade de DNA demonstra a necessidade prioritária de avaliação deste parâmetro. As considerações feitas podem ser auxiliares para que laboratórios de marcadores moleculares utilizem procedimentos de validação. Palavras-chave -Genética Vegetal. Microssatélites. Laboratórios biológicos -controle de qualidade.Abstract -Biodiversity information exchange and the use of genetic resources can be improved if the laboratories are able to assure their results thought suitable methodologies of validation. Aiming to define criteria which demonstrate the reliability of results in laboratories which work with DNA markers, errors associated to the DNA quantification in agarose gel, PCR repeatability and robustness using microsatellite (SSR) markers were analyzed. The error associated to DNA quantification was smaller when 100 ng of DNA were quantified, and increased for greater amounts of DNA, tending to sub estimations. Quantification limits, or the smallest quantity detected by the method used, varied markedly with small variations on the DNA amounts. Uncertainty associated to microsatellite PCR reaction was measured by its repeatability, which was affected by the quantities of DNA in the reaction. The low robustness of the microsatellite PCR reaction due to sensibility to quantities of DNA showed the priority on evaluating this parameter. The presented methodologies may be useful to laboratories working with molecular markers implementing validation procedures.

SSR markers to detect gene flow from upland to mocó cotton

“…When transgenic plants are not available or are not allowed, conventional non transgenic cultivars of the same species of the potential transgenic cultivars may be a confident model to measure gene flow, since plant transformation per se would change the amount of transgene flow. SSR markers, also known as microsatellite markers, are largely used in paternity analysis, and are well established for cotton genetic studies (OLIVEIRA et al, 2010). This report aimed to assess the existence of gene flow towards feral mocó cotton populations thought paternity analysis of offspring.…”

Erro experimental em marcadores AFLP: consequências e estimativas

“…Além disso, é importante que os laboratórios possam demonstrar que seus resultados são confiáveis, garantindo a repetitividade de testes por meio da validação de metodologias (OLIVEIRA et al, 2010). Ainda, é essencial que as atividades laboratoriais, como as diferentes técnicas de análise utilizadas, possam ser padronizadas no sentido de serem reproduzíveis entre diferentes laboratórios (JONES et al, 1997 Tal fato revela a grande utilização desta técnica.…”