Proses pemotongan hewan di Rumah Potong Hewan (RPH) harus dilakukan dengan baik dari pengangkutan hingga pemotongan agar tidak berakibat stres dan kesakitan pada hewan. Tujuan penelitian adalah untuk mengevaluasi apakah proses pemotongan ternak sapi di RPH telah memenuhi standar dan menerapkan prinsip animal welfare. Materi penelitian adalah 20 ekor Sapi Limosin dengan rata-rata bobot badan ±350 kg. Metode Penelitian adalah survey. Kasus yang diamati adalah kedaan fisiologis sebelum penyembelihan (P1) dan setelah penyembelihan (P2). Variabel yang diamati adalah kadar hormon Cortisol, Malondialdehid (MDA), Superoksida Dimustase (SOD). Data dianalisa menggunakan tabel anova dan menggunakan uji t. Hasil riset menunjukkan bahwa Kortisol dan MDA sebelum dilakukan penyembelihan (P1) berbeda sangat nyata (P≤0,01) dengan setelah dilakukan penyembelihan (P2). Rata-rata kadar hormon Kortisol sebelum penyembelihan adalah 47,6±1,22 nmol/L dan setelah penyembelihan adalah 58,16±2,22 nmol/L. Kadar MDA (P1) adalah 20,02±0,73 mmol/L dan P2 dalah 30,91±0,99 mmol/L. Kadar SOD sebelum penyembelihan (P1) berbeda nyata dengan setelah penyembelihan (P2). Rata-rata kadar SOD (P1) adalah 4,68±0,47 mmol/L dan (P2) adalah 3,78±0.08 mmol/L. Kesimpulan adalah perlakuan pemotongan di RPH masih menunjukkan adanya stres pada ternak. Saran dilakukan upaya pengurangan stres pada ternak terutama pada saat perobohan ternak sebelum disembelih.