Ανάλυση προσδεδμένων στο DNA πρωτεϊνών σε ασπόνδυλα (Ostrea edulis)

Abstract

Η πρωτεϊνική σύσταση του πυρήνα στο σπέρμα των δίθυρων μαλακίων αποτελεί ένα χαρακτηριστικό παράδειγμα της ποικιλότητας των ειδικών για το σπέρμα χρωματινικών πρωτεϊνών, καθώς στους οργανισμούς αυτούς συναντάται ένα μεγάλο εύρος δομικά διαφορετικών πρωτεϊνικών μορίων, τα οποία όμως εμφανίζουν πολύ κοντινές αμινοξικές συστάσεις. Με στόχο, λοιπόν, τη συνεισφορά στη συγκέντρωση στοιχείων, που θα αποτελόσουν τη βάση για τη μελλοντική κατανόηση του εναλλακτικού τρόπου οργάνωσης της χρωματίνης σε αυτόν τον τύπο γαμετικών κυττάρων, η παρούσα διδακτορική διατριβή επικεντρώθηκε στη μελέτη των σπερματικών, βασικών, πυρηνικών πρωτεϊνών ενός είδους δίθυρου, του Ostrea edulis (εδώδιμο στρείδι, Οικογένεια: Ostreidae). Η εκχύλιση των σπερματικών πρωτεϊνών με υδροχλωρικό οξύ και η σύγκρισή τους με τις χρωματινικές πρωτεΐνες των σωματικών κυττάρων έδειξε, ότι αυτές περιέχουν ένα πλήρες σύνολο κεντρικών ιστονών (Η2Α, Η2Β, Η3 και Η4), μαζί με τρεις ειδικές για το σπέρμα πρωτεΐνες, που ονομάστηκαν ΟΕ1, ΟΕ2 και ΟΕ3. Οι ΟΕ1 και ΟΕ2 παρουσιάζουν πολύ μικρή διαφορά στην ηλεκτροφορητική τους κινητικότητα και κινούνται λίγο αργότερα από την ιστόνη Η1 του θύμου μόσχου, ενώ η ΟΕ3 (η οποία εμφανίζεται ως τριπλέτα ζωνών) κινείται λίγο αργότερα από την ιστόνη Η3. Οι ΟΕ1 και ΟΕ2 έχουν πολύ κοντινές αμινοξικές συστάσεις, οι οποίες επιπλέον είναι χαρακτηριστικές πρωτεϊνικών μορίων, που ανήκουν στην οικογένεια της ιστόνης Η1. Η πέψη τους με βρωμιούχο κυάνιο δίνει προϊόντα ίδιας ηλεκτροφορητικής κινητικότητας και εμφανίζουν και οι δύο ένα ανθεκτικό στην πέψη με τρυψίνη πεπτίδιο με μοριακό βάρος ~ 8.5 kDa, αντίστοιχο δηλαδή του ανθεκτικού στην τρυψίνη πυρήνα της Η1 του θύμου μόσχου. Τα πιο πάνω στοιχεία συνδυασμένα, συναστούν ισχυρές ενδείξεις, ότι πρόκειται για πρωτεΐνες της Η1 οικογένειας με μεγάλη ομολογία μεταξύ τους. Η μεταφορά κατά Western και η επακόλουθη ανοσοεντόπιση έδειξαν, ότι οι ΟΕ1 και ΟΕ2 εμφανίζουν μεγάλη συγγένεια με την παρόμοια με την Η1 πρωτεΐνη PL-II* του Μ. trossulus. Με βάση τα βιοχημικά αυτά δεδομένα, οι πρωτεΐνες ΟΕ1 και ΟΕ2 κατατάσσονται στην κατηγορία PL-II των σπερματικών πρωτεϊνών των δίθυρων μαλακίων. Από την άλλη μεριά, η αμινοξική σύσταση της ΟΕ3 την κατατάσσει στις παρόμοιες με τις πρωταμίνες πρωτεΐνες.288Η αποικοδόμηση κατά Edman ενός πεπτιδίου (Ρ3), το οποίο προέκυψε από την πέψη με βρωμιούχο κυάνιο της ΟΕ2 έδωσε την αλληλουχία MKAAFAKGLKSGALVRPKGS, η οποία παρουσιάζει εντυπωσιακό βαθμό ομολογίας (85%) με κομμάτι του καρβοξυλικού άκρου του σφαιρικού πυρήνα της PL-II* πρωτεΐνης του Μ. trossulus. Η τελευταία εμφανίζεται στο σπέρμα με δύο παραλλαγές πρωτοταγούς δομής, οι οποίες ίσως μπορούν να παραλληλισθούν με τις δύο πρωτεΐνες OE 1 και ΟΕ2 του Ο. edulis. Στο μοριακό επίπεδο, στόχος ήταν ο εντοπισμός των γονιδίων των πρωτεϊνών ΟΕ1/2 και της ΟΕ3, ώστε να γίνει γνωστή η πλήρης αμινοξική αλληλουχία τους. Για το σκοπό αυτό κατασκευάστηκε μια cDNA βιβλιοθήκη ξεκινώντας από mRNA ώριμου και άωρου σπέρματος Ο. edulis. Από τη βιβλιοθήκη απομονώθηκαν και κλωνοποιήθηκαν δύο cDNA μόρια μεγέθους 428 bp (κλώνος col) και 306 bp (κλώνος co2). Και οι δύο κλώνοι περιελάμβαναν τμήμα του ανοιχτού πλαισίου ανάγνωσης της παρόμοιας με την Η1 πρωτεΐνης, όμως ακόμη και από αυτές τις μερικές αλληλουχίες επιβεβαιώθηκε η μεγάλη ομολογία της πρωτεΐνης του Ο. edulis με την αντίστοιχη του Μ. trossulus. Επίσης, οι κλώνοι αυτοί παρείχαν μία πρώτη ένδειξη για πιθανή κωδικοποίηση της ΟΕ3 σε κοινό ανοιχτό πλαίσιο ανάγνωσης με την ΟΕ1/2. Ένα γενωμικό κομμάτι μήκους 1018 bp, το οποίο περιελάμβανε ένα ανοιχτό πλαίσιο ανάγνωσης 750 bp, απομονώθηκε με PCR πολλαπλασιασμό από γενωμικό σπερματικό DNA. Η υποθετική μετάφραση αυτού του ανοιχτού πλαισίου ανάγνωσης έδειξε, ότι κωδικοποιεί για την ΟΕ1/2 αμέσως ακολουθούμενη από την ΟΕ3, ενώ μεταξύ τους παρεμβάλλεται μία θέση πρωτεόλυσης. Η διευθέτηση αυτή συναντάται επίσης σε άλλα δύο είδη δίθυρων μαλακίων, τα Μ. trossulus και Ε. minor. Οι αμινοξικές αλληλουχίες στις συνδέσεις μεταξύ των δύο πρωτεϊνών είναι ενδεικτικές ενός παρόμοιου μηχανισμού πρωτεόλυσης στα Ο. edulis και Μ. trossulus, ενώ φαίνεται να διαφέρει κάπως στο Ε. minor. Η συγκριτική μελέτη της αμινοξικής αλληλουχίας των πρωτεϊνών ΟΕ1/2 και ΟΕ3 με αντίστοιχες πρωτεΐνες άλλων δίθυρων μαλακίων, αποκαλύπτει τη σχεδόν απόλυτη ταύτιση της ΟΕ1/2 με την PL-II* του Μ trossulus, ενώ η ΟΕ3 εμφανίζει μεγαλύτερη συγγένεια με τις S πρωτεΐνες (πρωτεΐνες παρόμοιες με τις289πρωταμίνες) δύο άλλων ειδών στρειδιών, των G. yessoensis και S. swifti. Με βάση αυτήν την πρωτεϊνική σύσταση του σπερματικού πυρήνα, το Ο. edulis κατατάσσεται στην ομάδα 0 των δίθυρων μαλακίων, ομάδα στην οποία ανήκει και ένα άλλο στρείδι της ίδιας οικογένειας, το C. gigas. Οι μικρές αλλά σημαντικές διαφορές αλληλουχίας, που παρατηρούνται μεταξύ των cDNA κλώνων, του γενωμικού κομματιού και του Ρ3 πεπτιδίου αποκαλύπτουν την ύπαρξη αυτού του διπρωτεϊνικού ανοιχτού πλαισίου ανάγνωσης σε τρία τουλάχιστον αντίγραφα στο γονιδίωμα του Ο. edulis. Η πολυαντιγραφικότητα αυτή εξηγεί και τη μικροετερογένεια της ΟΕ3, η οποία είχε εκφραστεί ηλεκτροφορητικά. Η μικροετερογένεια των ειδικών για το σπέρμα πρωτεϊνών αποτελεί χαρακτηριστικό όλων των δίθυρων μαλακίων και επιβεβαιώνεται και στην περίπτωση του Ο. edulis. Εξελικτικά το Ο. edulis κατατάσσεται στην πιο πρωτόγονη ομάδα των δίθυρων, καθώς η σπερματική του χρωματίνη περιέχει κυρίως ιστόνες και μόνο μια μικρή, παρόμοια με τις πρωταμίνες πρωτεΐνη, γεγονός που μας επιτρέπει την πρόβλεψη, ότι η σπερματική του χρωματίνη θα εμφανίζει πολύ μικρές διαφορές από εκείνη των σωματικών κυττάρων.