Αξιολόγηση Της Ποιότητα, Ασφάλειας Και Αυθεντικότητας Του Κρέατος Με Ταχείες Μεταβολομικές Μεθόδους

Abstract

Οι ως τώρα έλεγχοι ασφάλειας, ποιότητας και αυθεντικότητας αφορούν πολύπλοκες τεχνικές, οι οποίες κατά γενική ομολογία είναι χρονοβόρες, δίνουν ετεροχρονισμένα αποτελέσματα και συχνά μεροληπτικά. Στα πλαίσια εκπόνησης της παρούσης διδακτορικής διατριβής με σκοπό να συναντηθούν οι ως άνω επιτηρήσεις σε εύλογο χρονικό διάστημα, αξιοποιήθηκε το μεταβολικό προφίλ (metabolomics), όπως αυτό προκύπτει από τις αναλυτικές πλατφόρμες: (α) Αέρια Χρωματογραφία συζευγμένη με Φασματομετρία Μάζας σε συνδυασμό με μικροεκχύλιση στερεής φάσης (HS/SPME-GC/MS), (β) ηλεκτρονική μύτη (e-nose), και (γ) Υγρή Χρωματογραφία Υψηλής Απόδοσης (HPLC) σε συνδυασμό με κλασσική μικροβιολογία και πολυμεταβλητή στατιστική. Στις περιπτώσεις που το ερώτημα ήταν «μικροβιολογικής φύσεως» τα δεδομένα των αισθητήρων συσχετίστηκαν με τις μικροβιακές αποκρίσεις. Σε εκείνες που αφορούσε ζητήματα αυθεντικότητας/νοθείας συσχετίστηκαν με τα μεταδεδομένα. Στο “Κεφάλαιο 2”, δείγματα κιμά (βόειος, χοιρινός, ανάμικτος: 70/30% βόειος/χοιρινός) συλλέχτηκαν τυχαία κατά τη διετή επισκόπηση απο μεγάλη βιομηχανική μονάδα της Αθήνας. Τα δείγματα αναλύθηκαν μικροβιολογικά και με GC/MS, όπου και αναπτύχθηκε μια επικυρωμένη μέθοδος για την αυθεντικότητα του κιμά με βάση το πτητικό προφίλ. Η Ανάλυση σε Κύριες Συνιστώσες (PCA) χρησιμοποιήθηκε για την απεικόνιση τυχόν ομαδοποίησεων. Εν συνεχεία η Ταξινόμηση Μερικών Ελαχίστων Τετραγώνων (PLS-DA) εφαρμόστηκε για να ταξινομήσει τα δείγματα και να συσχετίσει τις μεταβλητές με τις αντίστοιχες κατηγορίες κρέατος. Το σύνολο των δεδομένων χωρίστηκε 70/30% για βαθμονόμηση (70%) και έλεγχο του μοντέλου (30%) αντίστοιχα. Κατά τη βαθμονόμηση το 99, 100 και 100% των δειγμάτων ταξινομήθηκαν ορθά ως βόεια, χοιρινά και ανάμικτα αντίστοιχα, ενώ κατά τον έλεγχο τα αντίστοιχα ποσοστά ήταν 100, 100 και 95%. Και στα δύο υποσύνολα δεδομένων, η ΣΟΤ ανήλθε σε 99% κατά μέσο όρο. Εν συνεχεία, αναδείχτηκαν οι σημαντικές μεταβλητές (πτητικές ουσίες) κατά τη ταξινόμηση και συσχετίστηκαν με τις επιμέρους κατηγορίες κρέατος. Τέλος, αξιολογήθηκε η επίδραση της εποχής δειγματοληψίας, καθώς επίσης η ημέρα παρασκευής κιμά από τη σφαγή στο πτητικό προφίλ. Στο «Κεφάλαιο 3» για πρώτη φορά στη βιβλιογραφία διερευνήθηκε η μικροβιολογική και μεταβολομική (HPLC και GC/MS) σύσταση φιλέτων αλόγου κατά την συντήρηση σε παραδοσιακή συσευασία στους 0, 5, 10, και 15οC. Προέκυψε πως η μικροβιακή συσχέτιση πλησιάζει τα υπόλοιπα κόκκινα κρέατα, με αξιοσημείωτη υψηλή παρουσία Ζυμών και Μυκήτων. Υπολογίστηκε κατ’ εκτίμηση η εμπορική διάρκεια ζωής 263, 177, 92, 59 και 254, 169, 90, 58 ώρες βάσει της ΟΜΧ και ψευδομονάδων για τους 0, 5, 10, και 15οC αντίστοιχα. Αξιολογήθηκε η μικροβιολογική κατάσταση αναπτύσσσοντας μοντέλο παλινδρόμησης με μηχανές διανυσμάτων υποστήριξης (SVM-R) για πρόβλεψη της ΟΜΧ, όπου και υπολογίστηκε συντελεστής συσχέτισης 0,915 και 0,910 και RMSE 0.88 και 0.89 κατά την εκμάθηση με στους 0, 5 και 15oC και έλεγχο στους 10οC αντίστοιχα. Όσον αφορά τα HPLC αποτελέσματα, η συγκέντρωση του προπιονικού, μυρμηγκικού, γαλακτικού, και ηλεκτρικού οξέος μειιώθηκε κατά την αερόβια συντήρηση αλογίσιων φιλέτων. Παράλληλα, το οξικό, κιτρικό, βουτυρικό και ισοβουτυρικό οξύ αυξήθηκαν. Όσον αφορά το πτητικό προφίλ, η κορυφή της πεντανάλης, εξανάλης, οκτανάλης, εννεανάλης, δεκανάλης συσχετίστηκε θετικά με τα φρέσκα δείγματα, καθώς το διακετύλιο, ακετοϊνη, επτάν-2-όνη, οκτάν-2-όνη, εξανοϊκό οξύ, 3-&2-μέθυλο-βουτανόλη, και 3-μέθυλο-βουτανάλη με τα δείγματα με > 7,2 log10CFU/g. Tέλος, η εξανάλη, πεντανόλη, και 1-οκτέν-3-όλη συσχετίστηκαν θετικά με δείγματα με ΟΜΧ > 4,6 και < 7,2 log10CFU/g. Κατά το «Κεφάλαιο 4», στείρα (St) και φυσικά επιμολυσμένα (NC) μοσχαρίσια φιλέτα, συντηρήθηκαν αερόβια στους 2, 8 και 15 °C και αναλύθηκαν μικροβιολογικά ως προς την ΟΜΧ και ως προς τους επιμέρους μικροβιακούς μεταβολίτες (χρησιμοποιώντας HS/SPME-GC/MS και HPLC-PDA-RI). Η ανάλυση του βιοχημικού μονοπατιού, κατέδειξε σημαντικά μονοπάτια κατά τη συντήρηση: κύκλος κιτρικών, γλυκόλυση, μεταβολισμός πυρουβικού, μεταβολισμός δικαρβοξυκλικών, μεταβολισμός αμινοξέων. Οι ουσίες 3-&2-μεθυλο-1-βουτανόλη, 3-& 2-μεθυλο-1-βουτανάλη, 2-μεθυλο-1-προπανάλη, βουταν-2-όνη, πενταν-2-όνη, επταν-2-όνη, εννεαν-2-όνη, κιτρικό, οξικό και βουτυρικό οξύ αναδείχτηκαν ως δυνητικοί μικροβιακοί μεταβολίτες στο κρέας και συσχετίστηκαν με την αλλοιωμένη κατηγορία. Η Συνολικά Ορθή Ταξινόμηση (ΣΟΤ%) κατά τη Διακριτική ανάλυση Μερικών Ελαχίστων Τετραγώνων (PLS-DA) μεταξύ NC και S ήταν 100, 88 και 100% κατά την επαλήθευση για HPLC, GC/MS και συζευγμένο σύνολο δεδομένων. Τα αποτελέσματα του SVM-R μοντέλου απέδωσε τιμές για τη ρίζα μέσου τετραγωνικού σφάλματος (RMSE) 0,84, 0,74 και 0,58 κατά την εκμάθηση στους 2 και 15οC και 0,95, 0,99 και 0,82 κατά τον έλεγχο στους 8oC για HPLC, GC/MS και συζευγμένο σύνολο δεδομένων αντίστοιχα. Παράλληλα, η δυναμική της αλλοίωσης των στελεχών Serratia liquefaciens Β293 και Hafnia alvei Β295 μελετήθηκε in situ σε επιμολυσμένα φιλέτα υπό αερόβια συντήρηση στους 4 και 10oC και αναλύοντας με HS/SPME-GC/MS, HPLC-PDA-RI και HATR/FTIR (φασματοσκοπία υπερύθρου με μετασχηματισμό Fourier). Οι παραπάνω ενώσεις, συν οξικός ισοαμυλεστέρας, μεθανοθειόλη, 2,3-βουτανοδιόλη, βενζολοακεταλδεϋδη και βενζαλδεϋδη βρέθηκε ότι παράγονται από τα δύο στελέχη. Η ανάλυση βιοχημικού μονοπατιού κατέδειξε τον μεταβολισμό των πυρουβικών, κύκλο κιτρικών και τη γλυκόλυση ως τις σημαντικότερες βιοχημικές διεργασίες. Ός 1ον αφορά τα FTIR αποτελέσματα, και τα δυο στελέχη είχαν υψηλές απορροφήσεις στους κυμματαριθμούς που αντιστοιχούν στα αμίδια, αμίνες, και ακόρεστες αλδεύδες και κετόνες. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η μεταβολομική-προσέγγιση που αναπτύχθηκε σε αυτή τη διατριβή, σε συνδυασμό με πολυμεταβλητή στατιστική ανάλυση μπορεί να χρησιμοποιηθεί σαν εργαλείο προκαταρκτικού ελέγχου της μικροβιολογικής κατάστασης και αυθεντικότητας του κρέατος. Υπο προυποθέσεις, θα μπορούσε να αντικαταστήσει μερικώς τη χρονοβόρα και ετεροχρονισμένη ISO μέθοδο καταμέτρησης τρυβλίων.