Βιοποικιλότητα και ποσοτική εκτίμηση του πληθυσμού του Listeria monocytogenes σε νωπό κρέας και προϊόντα του

Abstract

Ο μικροοργανισμός Listeria monocytogenes είναι το παθογόνο αίτιο της λιστερίωσης. Μολονότι η συχνότητα εμφάνισης της νόσου στον άνθρωπο είναι σχετικά μικρή, τα κρούσματα λιστεριώσεων χαρακτηρίζονται από υψηλή θνητότητα (20-30%), ιδιαιτέρως μεταξύ ατόμων που ανήκουν σε ευαίσθητες ομάδες του πληθυσμού, όπως τα νεογνά, οι ηλικιωμένοι, οι έγκυες και οι ανοσοκατεσταλμένοι. Τις τρεις τελευταίες δεκαετίες τα καταγεγραμμένα κρούσματα λιστεριώσεων έχουν αυξηθεί σημαντικά, εξαιτίας ομαδικών προσβολών από L. monocytogenes τροφιμογενούς προέλευσης. Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η ποσοτικοποίηση της παρουσίας και η μελέτη της βιοποικιλότητας του παθογόνου μικροοργανισμού L. monocytogenes σε νωπό κρέας και προϊόντα του. Για την επίτευξη αυτού του σκοπού τέθηκαν ως κύριοι στόχοι μελέτης οι εξής: Η διεξαγωγή έρευνας πεδίου για τη μελέτη της μικροχλωρίδας και για την εκτίμηση της μικροβιολογικής ποιότητας και υγιεινής νωπού χοίρειου κιμά. Ο υπολογισμός του επιπολασμού του μικροοργανισμού L. monocytogenes σε νωπό χοίρειο κιμά, καθώς και ο προσδιορισμός των παραμέτρων-χαρακτηριστικών επίδοσης τριών μικροβιολογικών θρεπτικών υποστρωμάτων που χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση του παθογόνου στον κιμά. Ο προσδιορισμός του διαστήματος εμπιστοσύνης και της αβεβαιότητας καθεμίας των παραμέτρων επίδοσης των χρησιμοποιούμενων υποστρωμάτων, με εφαρμογή της μπαγεσιανής προσεγγιστικής μεθόδου. Η πρόβλεψη του επιπολασμού και της συγκέντρωσης του βακτηρίου L. monocytogenes σε νωπό χοίρειο κιμά, με χρήση της μπαγεσιανής προσεγγιστικής μεθόδου.2Η μελέτη της βιοποικιλότητας του L. monocytogenes σε νωπό χοίρειο κιμά με τη βοήθεια μοριακών μεθόδων αποτύπωσης του γονιδιώματος του μικροοργανισμού, όπως είναι η πολλαπλή αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (mPCR), η τυχαία ενίσχυση του πολυμορφικού DNA (RAPD) και η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης επαναλαμβανόμενων στοιχείων (rep-PCR).Οι πληθυσμοί των μικροοργανισμών, πλην του L. monocytogenes, οι οποίοι προσδιορίστηκαν κατά τη διεξαγωγή της προαναφερόμενης έρευνας πεδίου, επεξεργάστηκαν μέσω της πολυμεταβλητής στατιστικής ανάλυσης. Από τις κατανομές των μικροβιακών πληθυσμών στα δείγματα του νωπού χοίρειου κιμά που αναλύθηκαν, διαπιστώθηκε η επικράτηση των ψευδομονάδων έναντι όλων των υπολοίπων ομάδων μικροοργανισμών. Με τη βοήθεια εργαλείων της πολυμεταβλητής ανάλυσης οι μικροβιακοί πληθυσμοί αναδιατάχθηκαν σε κύριες συνιστώσες σχετιζόμενες με τη μικροβιολογική ποιότητα και υγιεινή του κρέατος.Όσον αφορά στον μικροοργανισμό L. monocytogenes, για τον ακριβή υπολογισμό του επιπολασμού του στο νωπό χοίρειο κιμά έγινε παράλληλη χρήση των μικροβιολογικών υποστρώματων PALCAM, ALOA και RAPID’L.mono. Κατόπιν αυτού, ο επιπολασμός του παθογόνου στον κιμά υπολογίστηκε στο 22%. Εξάλλου, η παράλληλη χρήση δύο τουλάχιστον χρωμογόνων θρεπτικών υποστρωμάτων, όπως είναι τα ALOA και RAPID’L.mono, σε συνδυασμό με την εφαρμογή της μπαγεσιανής προσεγγιστικής μεθόδου κατέστησε δυνατή την πρόβλεψη του επιπολασμού του L. monocytogenes στο νωπό χοίρειο κιμά. Μέσω της μπαγεσιανής ανάλυσης είναι δυνατός ο καλύτερος χειρισμός της αβεβαιότητας και για άλλες παραμέτρους, εκτός του επιπολασμού του μικροοργανισμού, όπως είναι η ευαισθησία και η ικανότητα εξειδίκευσης των χρησιμοποιούμενων θρεπτικών υποστρωμάτων. Ταυτόχρονα, με χρήση των αποτελεσμάτων παρουσίας και απουσίας του3μικροοργανισμού εκτιμήθηκε η συγκέντρωση του L. monocytogenes στον κιμά σε 14 και 17 cfu/kg προϊόντος με βάση τα υποστρώματα ALOA και RAPID’L.mono αντίστοιχα.Η μελέτη της βιοποικιλότητας του L. monocytogenes σε νωπό χοίρειο κιμά με τη βοήθεια της mPCR αποκάλυψε την παρουσία των ορότυπων 1/2a (77%), 1/2b (5%), 1/2c (1%), 4b (5%) και 4ab (10%), ενώ η ορολογική τυποποίηση ορισμένων στελεχών (2%) δεν ήταν δυνατή. Οι RAPD και rep-PCR διαχώρισαν και ομαδοποίησαν ικανοποιητικά το σύνολο των στελεχών του μικροοργανισμού που απομονώθηκαν από τον κιμά, συνεισφέροντας με αυτόν τον τρόπο στη διερεύνηση της γενετικής παραλλακτικότητας του L. monocytogenes. Σε ορισμένες περιπτώσεις ωστόσο, η γενετική ομοιότητα των στελεχών δεν σχετιζόταν με την προέλευσή τους.