Δευτερογενείς μεταβολίτες του φυτού Cedrus brevifolia

Abstract

Η παρούσα εργασία είναι μία σε βάθος μελέτη του χημικού περιεχομένου του φυτού Cedrus brevifolia (Hook.f.) Elwes & A. Henry της οικογένειας Pinaceae και επιχειρεί να ρίξει φως και στις εμπεριεχόμενες φυτοχημικές ομάδες, που φαίνεται να έχουν αγνοηθεί στη μοναδική προηγούμενη μελέτη στο είδος αυτό (Crețu et al., 2013). Μέχρι πρόσφατα, το είδος C. brevifolia θεωρείτο υποείδος του C. libani A. Rich. Η παρούσα μελέτη συμβάλλει στη χημειοταξινομική σύγκριση των δύο προαναφερθέντων ειδών. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή διεξήχθησαν τα ακόλουθα: Φυτοχημική ανάλυση, ήτοι απομόνωση και ταυτοποίηση των δευτερογενών μεταβολιτών με στόχο τον χαρακτηρισμό του χημικού φορτίου των εκχυλισμάτων:- διχλωρομεθανίου, μεθανόλης, μεθανόλης: H2O (5:1) των βελονών- διχλωρομεθανίου, μεθανόλης του φλοιού- κυκλοεξανίου, αιθυλικής αλκοόλης, αιθυλικής αλκοόλης: H2O (1:1) της ρητίνης. Έλεγχος της αντιοξειδωτικής και αντιφλεγμονώδους δράσης των εκχυλισμάτων και των δευτερογενών μεταβολιτών που απομονώθηκαν, δεδομένου ότι παραδοσιακά τα διάφορα είδη Κέδρου έχουν χρησιμοποιηθεί σε διάφορες παθήσεις σχετιζόμενες με την φλεγμονή. Ποιοτική και ποσοτική ανάλυση πτητικών συστατικών των τμημάτων του κορμού και της ρητίνης C. brevifolia Δενδροχρονολόγηση του δέντρου C. brevifolia. Συνολικά απομονώθηκαν 40 δευτερογενείς μεταβολίτες: Ι. Διχλωρομεθανικό εκχύλισμα βελονών: Απομονώθηκαν και ταυτοποιήθηκαν οκτώ διτερπένια και μια φυτοστερόλη: οξείδιο της μανοόλης-(13R) (3), ακετυλο-φυτόλη (4), δεϋδρο-αβιετικό οξύ (5), δεϋδρο-αβιετάλη (6), δεϋδρο-αβιετικός μεθυλεστέρας (7), 9,13α-επι-διοξο-8(14)-αβιετεν-18-οϊκό οξύ (8), 13-υδροξυλο-8,11,13-ποδοκαρπατριεν-18-oϊκό οξύ (9), 15-υδροξυ-δεϋδρο-αβιετικό-οξύ (10), καμπεστερόλη (11)ΙΙ. Μεθανολικό εκχύλισμα βελονών:Απομονώθηκαν και ταυτοποιήθηκαν ένα αποκαροτενοειδές, έντεκα φαινολικά παράγωγα και τρία φλαβονοειδή και μία ταννίνη:15-Ο-β-D-γλυκοπυρανοσυλο-αμπσισική αλκοόλη (12), trans-π-κουμαρικό οξύ (13), π-κουμαροϋλο 4-Ο-β-D-γλυκοσίδης (17), π-ανισικό οξύ (18), trans-βαγγινοσίδης (19), β-D-γλυκοσυλοξυλο-βενζοϊκό οξύ (20), βενζυλο-β-D-γλυκοπυρανοσίδης (21), βενζυλο-β-D-ρουτινοσίδης (22), γουαϊακυλο-β-D-γλυκοπυρανοσίδης (23), 3,4-διμεθοξυ-φαινυλο-1-β-D-γλυκοπυρανοσίδης (24), β-D-γλυκοπυρανοσυλο-φαινυλο-βουταν-2-όνη (25), 4-β-D-γλυκοπυρανοσυλο-4-υδροξυ-βενζοϊκό οξύ (26), αστραγαλίνη (29), ισοραμνετινο-3-Ο-β-D-γλυκοπυρανοσίδης (30), ταξιφολίνη (36), (-) (2S,3R)-κατεχίνη (40).ΙΙΙ. Εκχύλισμα μεθανόλης:Η2Ο (5:1) βελονώνΑπομονώθηκαν και ταυτοποιήθηκαν τέσσερα φλαβονοειδή:νικοτιφλορίνη (31), καιμπφεριδο-3-Ο-β-D-ρουτινοσίδης (32), τιλιροσίδης (33) συριγγετινο-3-Ο-β-D-γλυκοπυρανοσίδης (34)ΙV. Διχλωρομεθανικό εκχύλισμα φλοιούΑπομονώθηκε και ταυτοποιήθηκε ένα φαινολοξύ: (E)-φερουλικό οξύ (15)V. Μεθανολικό εκχύλισμα φλοιούΑπομονώθηκαν και ταυτοποιήθηκαν δύο φαινολικά οξέα, δύο φλαβονοειδή και μια διυδρο-χαλκόνη:(E)-φερουλικό οξύ (15), συριγγικό οξυ (16), κερκετίνη (28), εριοδικτυόλη (35), σιλισιόνη-β (37)VI. Κυκλοεξανικό εκχύλισμα ρητίνηςΑπομονώθηκαν και ταυτοποιήθηκαν τρία διτερπένια:μανοόλη (1), 3β-υδροξυ-μανοόλη (2), δεϋδρο-αβιετικό οξύ (5)VII. Εκχύλισμα αιθυλικής αλκοόλης ρητίνηςΑπομονώθηκαν και ταυτοποιήθηκαν δύο φαινολικά παράγωγα και δύο λιγνάνια:(E)-καφεϊκό οξύ (14), διβουτυλο- φθαλικός εστέρας (27), (+) λαρισιρεσινόλη (38), (+) 9-ακετυλο-λαρισιρεσινόλη (39)VIII. Εκχύλισμα αιθυλικής αλκοόλης: Η2Ο (1:1) ρητίνης. Απομονώθηκε και ταυτοποιήθηκε ένα λιγνάνιo: (+) λαρισιρεσινόλη (38)Από τους παραπάνω δευτερογενείς μεταβολίτες, οι 22 δεν έχουν απομονωθεί έως τώρα στο γένος Cedrus Trew: 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 16, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 35, 37, 39.Όσον αφορά την προγενέστερη μελέτη στο είδος C. brevifolia (Crețu et al., 2013), οι μεταβολίτες 36 και 40 είχαν ανιχνευθεί με HPLC-DAD-ESI-MS στο υδατοαλκοολικό εκχύλισμα του φλοιού. Τα εκχυλίσματα και οι απομονωμένες ουσίες ελέγχθηκαν in vitro ως προς την αντιοξειδωτική και αντιφλεγμονώδη δράση τους. Τα εκχυλίσματα μεθανόλης, μεθανόλης:Η2Ο (5:1) των βελονών, μεθανόλης του φλοιού, αιθυλικής αλκοόλης και αιθυλικής αλκόλης:Η2Ο (1:1) της ρητίνης έδειξαν θετικά αποτελέσματα ως προς την αντιοξειδωτική δράση σε όλες τις βιολογικές δοκιμές. Ειδικότερα το μεθανολικό εκχύλισμα του φλοιού, το εκχύλισμα αιθυλικής αλκοόλης και αιθυλικής αλκόλης: Η2Ο (1:1) της ρητίνης έδειξαν να αλληλεπιδρούν με την ελεύθερη ρίζα (DPPH) και να παρουσιάζουν καλύτερη ανασταλτική ικανότητα συγκριτικά με την ένωση αναφοράς (NDGA) σε ποσοστά 93%, 89% και 85%, αντίστοιχα. Επίσης, ανέστειλαν την υπεροξείδωση του μετά νατρίου άλατος του λινελαϊκού οξέος, που επάγεται από το (AAPH) σε ποσοστά 97%, 100% και 84% συγκριτικά με την ένωση αναφοράς (trolox). Ως προς την αντιφλεγμονώδη δράση μέσω της αναστολής της φυτικής λιποξυγονάσης (LOX), το εκχύλισμα μεθανόλης του φλοιού ήταν το πιο δραστικό σε ποσοστό 100%. Τα παραπάνω αποτελέσματα οδήγησαν στη διερεύνηση των δευτερογενών μεταβολιτών που είναι υπεύθυνοι για τις δράσεις αυτές.Οι ουσίες 14, 17, 28, 35, 36, 37, 38, 39, 40 έδειξαν αλληλεπίδραση με την σταθερή ρίζα DPPH, ενώ αναστολή της φυτικής λιποξυγονάσης (LOX) εμφάνισαν μόνο οι ουσίες 1, 14, 17, 35, 39. Οι ουσίες 17, 38, 39 εμφάνισαν αναστολή της υπεροξείδωσης του μετά νατρίου άλατος του λινελαϊκού οξέος, που επάγεται από το AAPH. Η ποιοτική και ποσοτική ανάλυση των πτητικών συστατικών των τμημάτων του κορμού, καθώς και της ρητίνης με GC-MS, ταυτοποιήθηκαν δεκαέξι ενώσεις στο εγκάρδιο τμήμα, δεκατέσσερεις ενώσεις στο σομφό που καλύπτουν 93.2% και 99.5% αντίστοιχα, ενώ επτά ενώσεις βρέθηκαν στη ρητίνη σε ποσοστό 99.9%, των συνολικών πτητικών συστατικών του. Κατά την δενδροχρονολόγηση, έγινε εξέταση ενός δίσκου ξύλου από τον κορμό του C. brevifolia και διαπιστώθηκε ότι το δέντρο ήταν μόλις 52 ετών όταν κόπηκε. Με βάση τη διάρκεια ζωής του γένους Cedrus Trew, το δικό μας δείγμα μπορεί να χαρακτηριστεί ως έφηβος. Οι δύο τελευταίες διεργασίες, της δενδροχρονολόγησης και της ποιοτικής και ποσοτικής ανάλυση πτητικών συστατικών των τμημάτων του κορμού έγιναν με σκοπό τη συσχέτιση της ηλικίας του δέντρου με την βιοσύνθεση πτητικών δευτερογενών μεταβολιτών.