Διερεύνηση Της Επίδρασης Φυσικών Προϊόντων, Προερχόμενων Από Φυτά Της Ελληνικής Χλωρίδας Στο Μεταβολισμό Των Οστών

Abstract

Αντικείμενο της παρούσας διδακτορικής διατριβής αποτέλεσε η φυτοχημική ανάλυση και φαρμακολογική μελέτη εκχυλισμάτων και απομονωμένων ενώσεων, προερχόμενων από φυτά της ελληνικής χλωρίδας, με σκοπό την ανακάλυψη φυσικών προϊόντων με ευεργετικές επιπτώσεις στην οστεοπόρωση. Οι βασικοί άξονες επιλογής των εμπλεκόμενων φυτικών ειδών ήταν: α) η αξιολόγηση πληροφοριών οι οποίες ανευρέθηκαν σε κείμενα των Αρχαίων Ελλήνων συγγραφέων θεραπευτών (Διοσκουρίδης, Ιπποκράτης, Θεόφραστος κ.ά.), β) η μελέτη σύγχρονων βιβλιογραφικών δεδομένων, τα οποία αναζητήθηκαν τόσο σε συγγράμματα παραδοσιακής θεραπευτικής, όσο και σε εργασίες δημοσιευμένες σε διεθνή επιστημονικά περιοδικά και γ) η αξιοποίηση δεδομένων τα οποία σχετίζονται με φυτικά είδη της ελληνικής χλωρίδας και αναφέρονται στην περιγραφή των μορφολογικών χαρακτηριστικών τους, τον ενδημισμό τους, την σπανιότητα, τον κίνδυνο εξαφάνισης τους κ.ά. Με βάση τα αποτελέσματα της αξιολόγησης των προαναφερόμενων πληροφοριών και σύγχρονα επιστημονικά δεδομένα επιλέχθηκαν 85 φυτικές δρόγες, οι οποίες μετά τη συλλογή και την ξήρανσή τους εκχυλίστηκαν κυρίως με τις τεχνικές της επιταχυνόμενης εκχύλισης και της υποβοηθούμενης με υπερήχους εκχύλισης. Έτσι, παρασκευάστηκαν 169 φυτικά εκχυλίσματα, τα οποία αξιολογήθηκαν αρχικά ως προς το χημικό τους περιεχόμενο, με τη χρήση των τεχνικών της χρωματογραφίας λεπτής στιβάδας υψηλής απόδοσης (HPTLC) και της υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης (HPLC).Βασιζόμενοι στο φυτοχημικό προφίλ των παραγόμενων εκχυλισμάτων επιλέχθηκαν τα πλέον ενδιαφέροντα για να αξιολογηθούν ως προς την οιστρογόνο/αντιοιστρογόνο και οστεοπροστατευτική δραστικότητά τους. Ο έλεγχος της οιστρογόνου / αντιοιστρογόνου δράση ςτων επιλεγμένων εκχυλισμάτων πραγματοποιήθηκε σε κύτταρα ανθρώπινου αδενοκαρκινώματος ενδομητρίου (Ishikawa), τα οποία έχουν την ικανότητα να παράγουν πλακούντια αλκαλική φωσφατάση, υπό την επίδραση οιστρογόνων ουσιών. Τα εκχυλίσματα που παρουσίασαν καλή οιστρογόνο ή/και αντιοιστρογόνο δράση στην προαναφερόμενη κυτταρική σειρά ελέγχθηκαν ως προς την ικανότητάς τους να επηρεάζουν των πολλαπλασιασμό και τη βιωσιμότητα ανθρώπινων κυττάρων αδενοκαρκινώματος μαστού (MCF-7). Οι κυτταρικές σειρές Ishikawa και MCF-7 χρησιμοποιούνται ευρύτατα για την ανεύρεση ενώσεων με οιστρογονικές / αντιοιστρογονικές ιδιότητες και αποτελούν ένα πολύ αξιόπιστο μοντέλο, μιας και θεωρείται ότι αναπαριστούν invitro την απόκριση σε οιστρογόνα και αντιοιστρογόνα των καρκινικών επιθηλιακών κυττάρων της μήτρας και του μαστού, αντίστοιχα.Για τον προσδιορισμό των οστεοπροστατευτικών ιδιοτήτων των παρασκευασμάτων,χρησιμοποιήθηκαν πρώιμα οστεοβλαστικά κύτταρα (MC3T3-Ε1) ικανά να διαφοροποιούνται σε ώριμους οστεοβλάστες. Η διαφοροποίηση σε ώριμους οστεοβλάστες τεκμηριώθηκε με τη μέτρηση της έκφρασης της αλκαλικής φωσφατάσης, ενζύμου το οποίο παράγεται και εκκρίνεται από τους οστεοβλάστες στο αρχικό στάδιο ωρίμανσής τους.Τα αποτελέσματα των προαναφερόμενων ελέγχων ανέδειξαν μια σειρά εκχυλισμάτων ως πιθανούς οστεοπροστατευτικούς παράγοντες, μεταξύ των οποίων το εκχύλισμα EtOAc και το μεθανολικό εκχύλισμα των ριζών του είδους Iris germanica (οικ. Iridaceae) επέδειξαν όχι μόνο αξιόλογες βιολογικές ιδιότητες, αλλά και αξιοσημείωτο φυτοχημικό προφίλ. Στη συνέχεια, με την εφαρμογή διαφόρων χρωματογραφικών τεχνικών (φυγόκεντρος χρωματογραφία κατανομής,χρωματογραφία μοριακού αποκλεισμού, παρασκευαστική χρωματογραφία λεπτής στιβάδας)επιτεύχθηκε ο εντοπισμός 26 δευτερογενών μεταβολιτών. Με τη χρήση φασματοσκοπικών τεχνικών (1D και 2D NMR, HRMS) πραγματοποιήθηκε η ταυτοποίηση και ο πλήρης χαρακτηρισμός των φασματοσκοπικών χαρακτηριστικών 23 απομονωμένων ενώσεων, οι οποίες ανήκουν στις κατηγορίες των ιριδαλών, ισοφλαβονοειδών, ακετοφαινονών, βενζοφαινονών και ξανθονών.Οι απομονωμένοι μεταβολίτες αξιολογήθηκαν ως δυνητικά οστεοπροστατευτικοί παράγοντες μέσω προσδιορισμού της ικανότητά τους να επάγουν τη διαφοροποίηση πρώιμων οστεοβλαστών (προ-οστεοβλαστικά κύτταρα MC3T3-E1) ή/και να καταστέλλουν τη διαφοροποίηση μακροφάγων κυττάρων σε οστεοκλαστών (μακροφάγα κύτταρα RAW264.7). Επίσης, προσδιορίστηκε η οιστρογονικότητά τους μέσω επαγωγής της έκφρασης της αλκαλικής φωσφατάσης στα κύτταρα Ishikawa, καθώς και του πολλαπλασιασμού των κυττάρων MCF-7 και εντοπίσθηκαν οι ενώσεις οι οποίες είναι υπεύθυνες για τις αξιόλογες ιδιότητες των αρχικών φυτικών παρασκευασμάτων.Ωστόσο, δεν είναι τυχαίο το γεγονός ότι οι ενώσεις αυτές αποτελούν δευτερογενείς μεταβολίτες και των άλλων ειδών του γένους Iris, τα οποία μελετήθηκαν στα πλαίσια της παρούσης μελέτης και επέδειξαν οστεοπροστατευτικές ιδιότητες. Επομένως, κρίθηκε σκόπιμη ηin vivo αξιολόγηση του μεθανολικού εκχυλίσματος των ριζών του είδους Iris unguicularis subsp. cretensis ως προς την επίδρασή του στη διατήρηση της οστικής πυκνότητας σε μοντέλο θήλεος ωοθηκεκτομημένου επίμυος (μοντέλο οστεοπόρωσης). Η επιλογή του συγκεκριμένου εκχυλίσματος βασίσθηκε κυρίως στο γεγονός ότι υπήρχε διαθέσιμη η απαιτούμενη ποσότητα φυτικού υλικού για την παρασκευή του εκχυλίσματος, παρόλο που το φυτό I. unguicularis subsp.cretensis αποτελεί ενδημικό είδος της ελληνικής χλωρίδας. Η πειραματική διαδικασία διήρκεσε έξι μήνες και προσδιορίστηκε η οστική πυκνότητα της αριστερής κνήμης των πειραματοζώων με τη μέθοδο DEXA κατά την έναρξη του πειράματος, καθώς και τον 3ο και 6ο μήνα. Καθ’ όλη τη διάρκεια του πειράματος πραγματοποιούνταν μετρήσεις του βάρους των επίμυων και κατά την ευθανασία, προσδιορίστηκε το βάρος των ζωτικών τους οργάνων. Επιπρόσθετα, τα μηριαία οστά υποβλήθηκαν σε ex vivo δοκιμασία καταπόνησης τριών σημείων, για να προσδιοριστεί η ανθεκτικότητα των οστών και οι δεξιές κνήμες σε τοπογραφικές μετρήσεις με τη μέθοδο pQCTγια τον προσδιορισμό της γεωμετρίας και της ποιότητάς τους.