Διερεύνηση της ρύθμισης της έκφρασης του bHLH μεταγραφικού παράγοντα neurogenin2 και της μεθυλοτρανσφεράσης της αργινίνης PRMT8 στο νευρικό περιβάλλον

Abstract

Στόχος αυτής της διατριβής ήταν η κατανόηση των μηχανισμών ρύθμισης της γονιδιακής έκφρασης επιγενετικών ρυθμιστών και μεταγραφικών παραγόντων που εμπλέκονται στην πορεία της νευρογένεσης και συγκεκριμένα της μεθυλοτρανσφεράσης της αργινίνης PRMT8 και της πρωτεΐνης Ngn2. Η μεθυλίωση των ιστονών σε κατάλοιπα αργινίνης αποτελεί έναν νέο μηχανισμό δυναμικής ρύθμισης της χρωματινικής δομής, και επιτελείται από μια κατηγορία ενζύμων που ονομάζονται PRMTs. Η πρωτεΐνη PRMT8 παρουσιάζει ενδιαφέρον επειδή, σε αντίθεση με τα υπόλοιπα μέλη, εκφράζεται αποκλειστικά στο νευρικό σύστημα αλλά ο ρόλος της στη διαδικασία της ενήλικης νευρογένεσης παραμένει άγνωστος. Θεμελιώδη ρόλο στη νευρογένεση, τη διατήρηση του δυναμικού των νευρικών βλαστικών κυττάρων και τον καθορισμό της κυτταρικής μοίρας παίζουν επίσης και οι μεταγραφικοί παράγοντες της οικογένειας bHLH. Ένα από τα προνευρικά γονίδια αυτής της οικογένειας που αποτελεί σημαντικό ρυθμιστή της νευρογένεσης είναι το Ngn2. Τα επίπεδα και η ενεργότητα της Ngn2 βρίσκονται υπό αυστηρό έλεγχο ο οποίος είναι θεμελιώδης για την έναρξη της διαδικασίας διαφοροποίησης. Παρόλα αυτά η ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης της Ngn2 δεν είναι καλά κατανοητή. Αναλύοντας το πρότυπο έκφρασης της PRMT8, δείξαμε ότι η PRMT8 συνεκφράζεται με την πρωτεΐνη NeuN η οποία εντοπίζεται στον πυρήνα των ώριμων νευρικών κυττάρων στην κοκκιώδη στοιβάδα της οδοντωτής έλικας, ενώ δεν συνεντοπίζεται με τον δείκτη DCX. Προκειμένου να διερευνήσουμε τον ρόλο της PRMT8 in vivo, κατασκευάσαμε πλασμιδιακούς φορείς με στόχο την παρασκευή ρετροϊών για την υπερέκφραση ή την καταστολή της πρωτεΐνης. Κατά τη διάρκεια αυτών των πειραμάτων, διαπιστώσαμε ότι το cDNA που είχαμε χρησιμοποιήσει και το οποίο αντιστοιχούσε στο mRNA που ήταν καταχωρημένο στη βάση δεδομένων, παρήγαγε μόνο τη μεμβρανική και όχι την πυρηνική μορφή. Μελετώντας αναλυτικότερα το 5’ άκρο του γονιδίου χρησιμοποιώντας τις μεθόδους cRACE ή 5’ RLM-RACE, ταυτοποιήσαμε μερικά εναλλακτικά μετάγραφα. Ένα από αυτά διαφέρει από τα μέχρι τώρα γνωστά και ενδεχομένως αντιπροσωπεύει την πυρηνική ισομορφή. Παράλληλα, διερευνήσαμε τα επίπεδα ρύθμισης της έκφρασης του γονιδίου Ngn2 κατά τη νευρική διαφοροποίηση, χρησιμοποιώντας ως μοντέλα πρόδρομα νευρικά κύτταρα (NPCs) από ιππόκαμπο ενήλικου επίμυος καθώς και ανθρώπινα νευροβλαστωματικά κύτταρα. Στα NPCs το γονίδιο εκφράζεται μέσα στις τρεις πρώτες ώρες της διαφοροποίησης, ενώ στη συνέχεια η έκφρασή του μειώνεται δραματικά. Στα νευροβλαστωματικά κύτταρα το mRNA αυξάνεται με προοδευτικό τρόπο κατά τη διαφοροποίηση και η έκφραση του διατηρείται σε σχετικά σταθερά και χαμηλά επίπεδα. Στις αντίστοιχες συνθήκες αλλά απουσία του RA που επάγει τη νευρική διαφοροποίηση, τα επίπεδα mRNA του γονιδίου είναι πολύ αυξημένα, επομένως η συνεχής παρουσία του RA είναι απαραίτητη για την ελεγχόμενη αύξηση του mRNA. Μελετώντας τις μεταβολές στο επίπεδο της πρωτεΐνης αντιληφθήκαμε μια αναντιστοιχία με τα αντίστοιχα επίπεδα του mRNA, η περαιτέρω διερεύνηση της οποίας μας έδειξε ότι εκτός από το επίπεδο της μεταγραφής, υπάρχει ένας ακόμη σημαντικός έλεγχος της έκφρασης του γονιδίου Ngn2 και στο επίπεδο της μετάφρασης και αποκάλυψε έναν μηχανισμό αρνητικής ανατροφοδότησης μεταξύ των επιπέδων της Ngn2 και της HuD, μιας πρωτεΐνης με ιδιότητες πρόσδεσης στο RNA, η οποία έχει την ικανότητα να ενισχύει ή να καταστέλλει τη μετάφραση των mRNA-στόχων. Στον μηχανισμό αυτό, σημαντικό ρόλο φαίνεται ότι έχει η 5’ μη μεταφραζόμενη περιοχή του Ngn2 mRNA τόσο για τη ρύθμιση της μετάφρασης όσο και για την αλληλεπίδραση της πρωτεΐνης Ngn2 με την HuD. Πειράματα υπερέκφρασης φανερώνουν ότι ένας μικρός αριθμός κυττάρων που εκφράζουν Ngn2 μπορεί να επηρεάζει την έκφραση της HuD στον ευρύτερο κυτταρικό πληθυσμό ενώ η συνέκφραση του Sox11, της οικογένειας ΗΜG, περιορίζει την έκφραση της HuD αποκλειστικά στα Ngn2+ κύτταρα, υποδηλώνοντας ότι η αλληλεπίδραση των μεταγραφικών παραγόντων Ngn2 και Sox11 μπορεί να συντονίζει τη ρύθμιση της έκφρασης και άλλων γονιδίων-στόχων τους. Η ανάλυση του συνόλου των γονιδίων που μεταγράφονται (RNAseq), σε διακριτά στάδια της νευρικής διαφοροποίησης στα οποία το πρότυπο έκφρασης της Ngn2 μεταβάλλεται με καθορισμένο τρόπο αποκάλυψε μια συντονισμένη ρύθμιση της έκφρασης συγκεκριμένων ομάδων γονιδίων στην πορεία της διαφοροποίησης που αποτελεί πηγή για μελλοντικές μελέτες με στόχο την βαθύτερη κατανόηση του δικτύου κομβικής σημασίας ρυθμιστών της νευρογένεσης, που η έκφραση τους προσαρμόζεται σε πολλαπλά επίπεδα, όπως είναι το Ngn2.