Διερεύνηση Και Κλινική Αξιολόγηση Νέων Δεικτών Μεθυλίωσης Του DNA Στον Καρκίνο, Στα Πλαίσια Της Υγρής Βιοψίας

Abstract

Η «υγρή βιοψία», βασισμένη στην ανάλυση των κυκλοφορούντων καρκινικών κυττάρων (circulating tumor cells, CTCs) και του εξωκυττάριου καρκινικού DNA (circulating tumor DNA, ctDNA) παρέχει μία μη-επεμβατική παρακολούθηση της εξέλιξης της νόσου και της αποτελεσματικότητας της θεραπείας, σε πραγματικό χρόνο. Η μελέτη της μεθυλίωσης του DNA, αποτελεί τα τελευταία χρόνια σημαντικό πεδίο έρευνας παγκοσμίως, καθώς αποτελεί πρώιμο γεγονός κατά την καρκινογένεση, αλλά λαμβάνει χώρα και σε όλα τα στάδια της νόσου. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή, αρχικά μελετήθηκαν οι προαναλυτικές παράμετροι σταθερότητας και πραγματοποιήθηκε αξιολόγηση της πιστότητας και ακρίβειας των αναλύσεων μεθυλίωσης του DNA στην υγρή βιοψία. Αποτελεί την πρώτη μελέτη αξιολόγησης της σταθερότητας της μεθυλίωσης του DNA στο πλάσμα και της μεθυλίωσης του χημικά τροποποιημένου DNA υπό διαφορετικές συνθήκες αποθήκευσης, Τα αποτελέσματά μας υποδεικνύουν ότι η πληροφορία της μεθυλίωσης δε διατηρείται εφόσον η απομόνωση του εξωκυττάριου καρκινικού DNA πραγματοποιηθεί από δείγματα πλάσματος συντηρημένα στους -70℃ για χρονική περίδο μεγαλύτερη των 8 μηνών. Αντίθετα, το χημικά τροποποιημένο DNA μπορεί να διατηρηθεί σε καταψύκτες και των -20℃ και των -70℃ για ένα έτος, χωρίς κανένα πρόβλημα στην ανάλυση μεθυλίωσης με real-time MSP. Αναφορικά με την ακρίβεια ενίσχυσης του χημικά επεξεργασμένου DNA, λάβαμε πανομοιότυπα αποτελέσματα πριν και μετά την αντίδραση ενίσχυσης. Εν συνεχεία, πραγματοποιήθηκε ανάπτυξη, επικύρωση και κλινική αξιολόγηση μεθοδολογίας για τη μεθυλίωση του γονιδίου ESR1, σε δείγματα CTCs και ctDNA, για την παρακολούθηση ασθενών με μεταστατικό καρκίνο μαστού που λαμβάνουν ενδοκρινή θεραπεία. Μέσω της αναπτυχθείσας μεθοδολογίας, αναφέρουμε για πρώτη φορά την ανίχνευση μεθυλίωσης του ESR1 στα CTCs και την υψηλή αντιστοιχία με τη μεθυλίωση στο ctDNA πλάσματος των ίδιων ασθενών. Επιπλέον, η μεθυλίωση του ESR1 στα CTCs ασθενών με ορμονοεξαρτώμενο καρκίνο μαστού, βρέθηκε να παρουσιάζει στατιστικά σημαντική συσχέτιση με την έλλειψη ανταπόκρισης στην ορμονοθεραπεία (everolimus/exemestane).Επιπρόσθετα, αναπτύξαμε, επικυρώσαμε και αξιολογήσαμε κλινικά μία νέα μέθοδο για τη μεθυλίωση του υποκινητή του γονιδίου MLL3. Με βάση τη μεθοδολογία αυτή, αξιολογήσαμε τη μεθυλίωση του MLL3 ως νέο επιγενετικό βιοδείκτη στο μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν για πρώτη φορά την ύπαρξης μεθυλίωσης του MLL3 και την προγνωστική αξία της ανίχνευσής της στο ctDNA από πλάσμα ασθενών με μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα. Τέλος, πραγματοποιήσαμε μελέτη μεθυλίωσης ογκοκατασταλτικών γονιδίων σε CTCs απομονωμένα με το σύστημα Parsortix, από ασθενείς με πλακώδες καρκίνωμα κεφαλής και τραχήλου. Τα γονίδια SOX17, RASSF1A και MLL3 βρέθηκαν μεθυλιωμένα σε διαφορετικά ποσοστά, επιβεβαιώνοντας την ετερογένεια των CTCs.