Δομική Μελέτη Του Φωτοσυστήματος ΙΙ Των Ανωτέρων Φυτών Και Φασματοσκοπική Μελέτη Της Λύασης Του Υδροϋπεροξειδίου Των Λιπαρών Οξέων

Abstract

Το Φωτοσύστημα ΙΙ είναι ένα μεμβρανικό πολυπρωτεϊνικό σύμπλοκο, το οποίο καταλύει την διάσπαση του νερού, μέσω ενός μοναδικού μηχανισμού. Οι σημαντικές λειτουργικές ιδιότητες του συμπλόκου αυτού αποδίδονται στα μοναδικά δομικά χαρακτηριστικά του. Η δομική μελέτη του PS II ξεκινά από το επίπεδο της τοπολογίας των πρωτεϊνών στο σύμπλοκο και καταλήγει στο επίπεδο της μοριακής δομής. Από έμμεσες βιοχημικές μελέτες έχουν προκύψει μοντέλα για τη σχετική θέση και οργάνωση των υπομονάδων του PS II. Τα τελευταία χρόνια μελέτες με ηλεκτρονικό μικροσκόπιο έχουν δώσει μια εικόνα για την τοπολογία του συμπλόκου στο χώρο. Οι μόνες πληροφορίες για την δομή του PS II σε μοριακό επίπεδο προέρχονται από τα φωτοσυνθετικά μωβ βακτήρια η δομή των οποίων έχει προσδιοριστεί με κρυσταλλογραφία ακτίνων-Χ. Μέχρι σήμερα απουσιάζει το τρισδιάστατο μοντέλο που θα απεκάλυπτε τα μοναδικά δομικά χαρακτηριστικά του PS II σε ατομικό επίπεδο. Στη παρούσα εργασία στόχος ήταν η δομική μελέτη του PS II σε μοριακό επίπεδο και στο επίπεδο της οργάνωσης των πρωτεϊνών στο σύμπλοκο. H μελέτη της μοριακής δομής του PS II στηρίχθηκε στην ανάπτυξη τρισδιάστατων κρυστάλλων και ανάλυση της δομής με κρυσταλλογραφία ακτίνων-Χ. Η ανάλυση της τεταρτοταγούς δομής του PS II βασίστηκε στη μελέτη του συμπλόκου του ενεργού κέντρου με ηλεκτρονική μικροσκοπία. Στα πλαίσια της κρυστάλλωσης του PS II αναπτύχθηκε ένα νέο πρωτόκολλο απομόνωσης, το οποίο εξασφαλίζει την ποσοτική απομόνωση της CP 47 και του συμπλόκου του ενεργού κέντρου σε σταθερή κατάσταση. Το πρωτόκολλο βασίζεται στην επιλεκτική αποδέσμευση των μεμβρανικών πρωτεϊνών με κατάλληλο συνδυασμό απορρυπαντικών και εμπλουτισμό των υποσυμπλόκων με υπερφυγοκέντρηση σε γραμμική διαβάθμιση σουκρόζης. Για πρώτη φορά επιτεύχθηκε η κρυστάλλωση μιας μεμβρανικής πρωτεΐνης του PS II. Για την βελτίωση των κρυστάλλων της CP 47 πραγματοποιήθηκε συστηματική μελέτη των παραμέτρων που επηρεάζουν την κρυστάλλωση των μεμβρανικών πρωτεϊνών. Η χαμηλή ικανότητα περίθλασης των κρυστάλλων αποδόθηκε στη διάσπαση της CP 47. H διάσπαση της CP 47 ξεκινά αμέσως μετά την αποδέσμευση της από το υπόλοιπο σύμπλοκο και συνεχίζεται στο σκοτάδι. Η ευαισθησία της CP 47 αποδίδεται σε αλλαγή της δομής που οφείλεται στην αποδέσμευση της πρωτεΐνης από το πυρήνα. Από τη δομική μελέτη του συμπλόκου του ενεργού κέντρου του PS II προέκυψαν πληροφορίες για την κατάσταση ολιγομερισμού του και την θέση των μεμβρανικών πρωτεϊνών στον πυρήνα του PS II. To σύμπλοκο του ενεργού κέντρου απομονώθηκε σε μονομερή μορφή και το μοριακό του βάρος προσδιορίστηκε με συνδυασμό δύο ανεξάρτητων τεχνικών. Από την ανάλυση των εικόνων που ελήφθησαν στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο προέκυψε ο χάρτης κατανομής της πρωτεϊνικής πυκνότητας των υπομονάδων D1 και D2. Από την σύγκριση του χάρτη του συμπλόκου του ενεργού κέντρου με το χάρτη ολόκληρου του πυρήνα αποκαλύφθηκε η σχετική θέση των κυριοτέρων μεμβρανικών πρωτεϊνών. Οι πρωτεΐνες D1 και D2 εντοπίζονται στο κέντρο, ενώ οι CP 47 και CP 43 στην περιφέρεια του συμπλόκου, προσδίδοντας στο πυρήνα του PS II ψευδοσυμμετρία δευτέρας τάξης. Επίσης στην παρούσα διατριβή πραγματοποιήθηκε η μελέτη της λυάσης του υδροϋπεροξειδίου των λιπαρών οξέων (HPO lyase). Το ένζυμο αυτό είναι ευρύτατα διαδεδομένο στο φυτικό βασίλειο και τα προϊόντα της δράσης του εμπλέκονται στον αμυντικό μηχανισμό των φυτών. Η ΗPO lyase ανήκει σε μία νέα κατηγορία ενζύμων (CYP 74), τα οποία προτείνεται ότι ανήκουν στην οικογένεια των κυτοχρωμάτων P450. Τα ένζυμα της κατηγορίας CYP74 εμφανίζουν μοναδικά λειτουργικά χαρακτηριστικά, αφού δεν χρειάζονται αναγωγικό και οξυγόνο για την δράση τους και επιδεικνύουν υψηλούς ρυθμούς ανακύκλησης σε αντίθεση με τα P450. Στην παρούσα εργασία η HPO lyase απομονώθηκε από βακτήρια Ε. coli, τα οποία περιέχουν το ανασυνδιασμένο DNA του ενζύμου από πιπεριά. Από τα βακτήρια η ΗPO lyase εκφράστηκε σε ικανοποιητική ποσότητα, που επέτρεψε τον βιοχημικό και φασματοσκοπικό χαρακτηρισμό του ενζύμου. Η εργασία επικεντρώθηκε στη δομική μελέτη του περιβάλλοντος της αίμης στο ενεργό κέντρο του ενζύμου με φασματοσκοπία απορρόφησης ορατού-υπεριώδους (UV-Vis) και φασματοσκοπία ηλεκτρονικού παραμαγνητικού συντονισμού (EPR). Η φασματοσκοπική μελέτη του ενζύμου στηρίχτηκε στη δέσμευση εξωγενών ligands στο σίδηρο της αίμης του καταλυτικού κέντρου του ένζυμου και στην σύγκριση των φασματοσκοπικών χαρακτηριστικών, με εκείνα πρωτεϊνών με γνωστή δομή. Από τις μελέτες αυτές αποκαλύφθηκε ότι ο αιμικός σίδηρος είναι πεντασυναρμοσμένος και βρίσκεται σε κατάσταση υψηλού spin. Από την εργασία αυτή ελήφθησαν για πρώτη φορά φασματοσκοπικά δεδομένα, τα οποία στηρίζουν την υπόθεση ότι στη πέμπτη θέση συναρμογής της αίμης υπάρχει κυστεΐνη και κατά συνέπεια η HPO lyase είναι ένα κυτόχρωμα P450.