Εμβρυϊκή Και Νεογνική Νευροτοξικότητα Και Ηπατοτοξικότητα Της Αιθανόλης Και Της Ελλιπούς Σε Θειαμίνη Διατροφής

Abstract

Εισαγωγή: Είναι γνωστό ότι οι δραστικότητες των ενζύμων του εγκεφάλου, ακετυλχολινεστεράση (AChE), Νa+,Κ+-ΑΤΡάση και Mg2+-ATPάση, αποτελούν κρίσιμες παραμέτρους για την εκτίμηση της χολινεργικής λειτουργίας, της συναπτικής διεγερσιμότητας, αλλά και τον έλεγχο του ρυθμού πρωτεϊνοσύνθεσης και της κυτταρικής ανάπτυξης, αντίστοιχως. Οι δραστικότητες των ανωτέρω ενζύμων, υπόκεινται σε μεταβολές από την δράση ελευθέρων ριζών, ενώ παρουσιάζουν σημαντικές αποκλίσεις μεταξύ των διαφόρων εγκεφαλικών περιοχών κατά την πειραματική επαγωγή μεταβολικών διαταραχών οι οποίες επηρεάζουν (μεταξύ άλλων) και το ΚΝΣ. Σκοπός της παρούσας μελέτης είναι: (α) η διερεύνηση των επιδράσεων της ήπιας in vivo χορήγησης αιθανόλης (EtOH) (10% v/v στο πόσιμο ύδωρ) σε κυοφορούντες επίμυες, επί της δραστικότητας της AChE, της Νa+,Κ+-ΑΤΡάσης και της Mg2+-ATPάσης, τόσο σε ομογενοποιήματα ολικού εγκεφάλου, όσο και επί των ομογενοποιημάτων εγκεφαλικών δομών (μετωπιαίος φλοιός, ιππόκαμπος, υποθάλαμος, παρεγκεφαλίδα και γέφυρα) των απογόνων, όταν αυτή χορηγήθηκε καθ’ όλη τη διάρκεια της κύησης, αλλά και όταν χορηγήθηκε καθ’ όλη τη διάρκεια τόσο της κύησης, όσο και της γαλουχίας, καθώς και (β) η διερεύνηση των επιδράσεων της ήπιας in vivo χορήγησης EtOH ή/και δίαιτας ελλιπούς σε θειαμίνη (TDD) σε κυοφορούντες επίμυες, κατά τη διάρκεια της κύησης, επί της δραστικότητας των τριών ανωτέρω ενζύμων στα ομογενοποιήματα ολικού εγκεφάλου των απογόνων, σε συνδυασμό με τη μελέτη της ιστολογικής εικόνας του ήπατος αυτών, τόσο κατά την γέννηση, όσο και μετά το πέρας της γαλουχίας.Υλικά και Μέθοδοι: Για τoυς in vivo πειραματισμούς χρησιμοποιήθηκαν ενήλικες θήλεις και άρρενες επίμυες τύπου AlbinoWistar, οι οποίοι λάμβαναν τροφή και ύδωρ ανάλογα με τη διάθεση τους (ad libitum). Στη 1η πειραματική φάση οι θήλεις επίμυες αρχικά συστεγάστηκαν σε κλωβούς με άρρενες επίμυες (επιβήτορες), σε αναλογία 1 : 2 (αρσενικά : θήλεα), για να ζευγαρώσουν. Αφού επαληθεύτηκε το ζευγάρωμα, μετά από λήψη κολπικού επιχρίσματος, οι θήλεις επίμυες διαχωρίστηκαν από τους άρρενες επίμυες και διαχωρίστηκαν σε τρείς ομάδες: (i) ομάδα μαρτύρων (Control) (χορηγήθηκε κανονική δίαιτα και νερό βρύσης τόσο κατά την κύηση όσο και κατά τη γαλουχία), (ii) ομάδα EtOH(G) (χορηγήθηκε κανονική δίαιτα και 10% v/v EtOH, διαμέσω του πόσιμου ύδατος, κατά την κύηση), και (iii) ομάδα EtOH (G+L) (χορηγήθηκε κανονική δίαιτα και 10% v/v EtOH, διαμέσω του πόσιμου ύδατος, τόσο κατά την κύηση όσο και κατά την διάρκεια της γαλουχίας). Μετά το πέρας της γαλουχίας, οι ηλικίας 21 ημερών απόγονοι επίμυες από κάθε όμαδα ζυγίστηκαν και θανατώθηκαν με ακαριαίο αποκεφαλισμό, και ακολούθως, οι εγκέφαλοι τους απομονώθηκαν τάχιστα, παρέχοντας τα δείγματα εγκεφαλικού ιστού για τις αντίστοιχες υποομάδες Control, EtOH(G) και EtOH(G+L). Οι υπόλοιποι 21-ημερών απόγονοι επίμυες, χρησιμοποιήθηκαν έτσι ώστε να απομονωθεί ικανός αριθμός για κάθε μια από τις ακόλουθες εγκεφαλίκες δομές, επαρκής για τον προσδιορισμό των υπό μελέτη νευροχημικών παραμέτρων στα ομογενοποιήματα κάθε δομής: μετωπιάιος φλοίος, ιππόκαμπος, υποθάλαμός, περεγκεφαλίδα και γέφυρα. Στη 2η πειραματική φάση, αφού επαληθεύθηκε το ζευγάρωμα με τον ίδιο τρόπο όπως περιγράφηκε παραπάνω, οι θήλεις επίμυες διαχωρίστηκαν από τους άρρενες επίμυες και διαχωρίστηκαν σε τέσσερις ομάδες. Οι ομάδες που σχηματίστηκαν ήταν οι ακόλουθες: (i) ομάδα μαρτύρων (Control) (χορηγήθηκε κανονική δίαιτα και νερό βρύσης τόσο κατά την κύηση όσο και κατά τη γαλουχία), (ii) ομάδα EtOH (χορηγήθηκε κανονική δίαιτα και 10% v/v EtOH, διαμέσω του πόσιμου ύδατος, κατά την κύηση, (iii) ομάδα TDD (χορηγήθηκε ειδική τροφή ελλιπής στη βιταμίνη T και νερό βρύσης κατά την κύηση), και iv) ομάδα συνχορήγησης TDD+EtOH (συνχορηγήθηκε 10% v/v EtOH, διαμέσω του πόσιμου ύδατος, και ειδική τροφή ελλιπής στη βιταμίνη T κατά την κύηση). Σε κάθε ομάδα η χορήγηση των παραγόντων διήρκησε όσο και η κύηση. Κατά τη γέννηση, ικανός αριθμός νεογέννητων επίμυων από κάθε όμαδα ζυγίστηκαν και θανατώθηκαν με ακαριαίο αποκεφαλισμό, και ακολούθως, οι εγκέφαλοι τους απομονώθηκαν τάχιστα παρέχοντας τα δείγματα εγκεφαλικού ιστού για τις αντίστοιχες υποομάδες Control1, EtOH1, TDD1 και EtOH1+TDD1. Οι υπόλοιποι νεογέννητοι επίμυες από κάθε ομάδα αφέθηκαν να αναπτυχθούν, ενώ η χορήγηση τρόφης και νερού επανήλθε στο φυσιολογικό (όπως στην ομάδα Control) για όλες τις όμαδες. Μετά το πέρας της γαλουχίας, ικανός αριθμός των ηλικίας 21 ημερών απογόνων επίσης ζυγίστηκε και θανατώθηκε με ακαριαίο αποκεφαλισμό, και ακολούθως, οι εγκέφαλοι τους απομονώθηκαν τάχιστα παρέχοντας τα δείγματα εγκεφαλικού ιστού για τις για τις αντίστοιχες υποομάδες Control21, EtOH21, TDD21 και EtOH21+TDD21. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι όλες οι ομάδες απογόνων και στις δύο πειραματικές φάσεις αποτελούνταν από επίμυες και των δύο φύλων. Εν συνεχεία, οι ολικοί εγκέφαλοι και οι εγκεφαλικές δομές (μετωπιαίος φλοιός, ιππόκαμπος, υποθάλαμος, παρεγκεφαλίδα και γέφυρα) της 1ης πειραματικής φάσης, καθώς και οι ολικοί εγκέφαλοι και τα ήπατα της 2ης πειραματικής φάσης, μετακινήθηκαν γρήγορα, πλύθηκαν με ισοτονικό διάλυμα και ζυγιστήκαν άμεσα. Τα ήπατα, ακολούθως, τοποθετήθηκαν σε διάλυμα φορμόλης και ακολούθησε χρώση με αιματοξυλίνη–ηωσίνη. Οι ολικοί εγκέφαλοι και οι δομές εγκεφάλου ομογενοποιήθηκαν και εν συνεχεία μετρήθηκαν οι ενζυμικές δραστικότητες της AChE, της (Νa+,Κ+)- και της Mg2+-AΤΡάσης σε όλες τις προαναφερθείσες ομάδες.Αποτελέσματα: Στη 1η πειραματική φάση, η έκθεση σε EtOH κατά τη διάρκεια της κύησης προκάλεσε σημαντική μείωση στη δραστικότητα της AChE στον ολικό εγκέφαλο, όσο και στο μετωπιαίο φλοιό των απογαλακτισθέντων (ηλικίας 21 ημερών) απογόνων. Επίσης, σημαντική μείωση παρατηρήθηκε και στη δραστικότητα της AChE στο μετωπιαίο φλοιό των ηλικίας 21 ημερών απογόνων επιμύων, στην οποία χορηγήθηκε EtOH τόσο κατά τη διάρκεια της κύησης όσο και κατά τη γαλουχία. Η δραστικότητα της Νa+,Κ+-ΑΤΡάσης στο μετωπιαίο φλοιό των ηλικίας 21 ημερών απογόνων επιμύων τόσο της ομάδας EtOH(G), όσο και της ομάδας EtOH(G+L), βρέθηκε ιδιαίτερα αυξημένη συγκριτικά με την ομάδα Control. Ενδιαφέρον, αποτελεί το γεγονός ότι η δραστικότητα της Νa+,Κ+-ΑΤΡάσης στην παρεγκεφαλίδα και στη γέφυρα των ηλικίας 21 ημερών απογόνων επιμύων της ομάδας EtOH(G), σημείωσαν στατιστικώς σημαντική μείωση συγκριτικά με την ομάδα Control. H δραστικότητα της Mg2+-ATPάσης στoν ιππόκαμπο των ηλικίας 21 ημερών απογόνων επιμύων τόσο της ομάδας EtOH(G), όσο και της ομάδας EtOH(G+L), βρέθηκε στατιστικώς σημαντικά αυξημένη συγκριτικά με την ομάδα Control. Τέλος, η δραστικότητα της Mg2+-ATPάσης στoν υποθάλαμο των ηλικίας 21 ημερών απογόνων επιμύων της ομάδας EtOH(G+L) βρέθηκε σημαντικά αυξημένη συγκριτικά με την ομάδα Control, ενώ αύξηση παρατηρήθηκε επίσης και στην παρεγκεφαλίδα των ηλικίας 21 ημερών απογόνων επιμύων της ομάδας EtOH(G+L), όταν η τελευταία συγκρίθηκε με την ομάδα EtOH(G). Στη 2η πειραματική φάση, παρατηρήθηκε σημαντική αύξηση στη δραστικότητα της AChE στον ολικό εγκέφαλο των νεογέννητων επιμύων στην οποία χορηγήθηκε TDD κατά την κύηση, συγκριτικά με την ομάδα Control1. Επίσης, σημαντική αύξηση παρατηρήθηκε και στη δραστικότητα της AChE στον ολικό εγκέφαλο των ηλικίας 21 ημερών απογόνων στην ομάδα EtOH21, στην οποία χορηγήθηκε EtOH κατά την κύηση, συγκριτικά με την ομάδα Control21. Αντίθετα, στην ομάδα TDD21+EtOH21 στην οποία συγχορηγήθηκε EtOH και TDD κατά την κύηση, παρατηρήθηκε μείωση στη δραστικότητα της AChE στον ολικό εγκέφαλο των ηλικίας 21 ημερών απογόνων, συγκριτικά με την ομάδα Control21. Ομοίως, σημαντική μείωση στη δραστικότητα της AChE στον ολικό εγκέφαλο των ηλικίας 21 ημερών απογόνων επιμύων παρατηρήθηκε και στην ομάδα συγχορήγησης TDD21+EtOH21, όταν αυτή συγκρίθηκε με την ομάδα TDD21. Στη δραστικότητα της Νa+,Κ+-ΑΤΡάσης παρατηρήθηκε σημαντική μείωση στον ολικό εγκέφαλο των νεογέννητων επιμύων στην ομάδα TDD1, εν αντιθέσει με τις ομάδες EtOH1 και ΤDD1+EtOH1 στις οποίες παρατηρήθηκε σημαντική αύξηση στη δραστικότητα της Νa+,Κ+-ΑΤΡάσης, συγκριτικά με την ομάδα Control1. Επιπρόσθετα, σημειώθηκε ιδιαίτερα σημαντική αύξηση στη δραστικότητα της Νa+,Κ+-ΑΤΡάσης στον ολικό εγκέφαλο των νεογέννητων επιμύων της ομαδας ΤDD1+EtOH1 όταν αυτή συγκρίθηκε με την ομάδα TDD1. Τέλος, στατιστικώς σημαντική αύξηση στη δραστικότητα της Νa+,Κ+-ΑΤΡάσης παρατηρήθηκε και στον ολικό εγκέφαλο των ηλικίας 21 ημερών απογόνων της ομάδας TDD21+EtOH21, όταν αυτή συγκρίθηκε με την ομάδα Control21. Η δραστικότητα της Mg2+-ATPάσης στον ολικό εγκέφαλο τόσο των νεογέννητων επιμύων όσο και στον ολικό εγκέφαλο των ηλικίας 21 ημερών απογόνων, παρέμεινε ανεπηρέαστη σε όλες τις υπο μελέτη ομάδες είτε όταν αυτές συγκρίθηκαν με τις ομάδες Control1 και Control21, είτε με τις ομάδες TDD1 και TDD21. Τέλος, στα ιστοπαθολογικά αποτελέσματα της 2ης πειραματικής φάσης δεν παρατηρήθηκαν αξιοσημείωτες μεταβολές (συγκριτικά με τις αντίστοιχες ομάδες μαρτύρων), τόσο στις ομάδες έκθεσης των νεογέννητων απογόνων, όσο και σε αυτές των ηλικίας 21 ημερών απογονών.Συμπεράσματα: Ο πειραματικός σχεδιασμός που εφαρμόστηκε στην 1η πειραματική φάση συγκρίνει τις νευροτοξικές επιδράσεις της μητρικής έκθεσης σε EtOH σε ένα ευρύτερο χρονικό πλαίσιο (κύηση και γαλουχία), το οποίο στον άνθρωπο αντιστοιχεί στην νευροαναπτυξιακή περίοδο του ΚΝΣ κατά το τρίτο τρίμηνο κύησης, και επιπλέον, φανέρωσε μια ευαισθησία των υπό εξέταση κριτικών νευροχημικών παραμέτρων ανά συγκεκριμένη εγκεφαλική περιοχή, στα σχήματα έκθεσης σε EtOH τα οποία εφαρμόστηκαν. Αναφορικά με τα ευρήματα αναστολής της δραστικότητας της AChE, πιθανόν να οφείλονται στα χαμηλότερα εγκεφαλικά αποθέματα ACh (υπόστρωμα της AChE) των ηλικίας 21 ημερών απογόνων έπειτα από τη μητρική χορήγηση EtOH, τόσο κατά την διάρκεια της κύησης, όσο και κατά τη διάρκεια της κύησης σε συνδυασμό με τη γαλουχία. Ανάμεσα στις υπό εξέταση ενζυμικές παραμέτρους, ιδιαίτερης σημασίας χρήζει η εκτεταμένη διέγερση της Νa+,Κ+-ΑΤΡάσης στο μετωπιαίο φλοίο των ηλικίας 21 ημερών απογόνων, η οποία πιθανώς να οφείλεται στον μειωμένο βαθμό διακλάδωσης των δενδριτών στη συγκεκριμένη εγκεφαλική δομή εξαιτίας της μητρικής έκθεσης σε EtOH. Αντίθετα, στη παρεγκεφαλίδα παρατηρήθηκε μείωση της δραστικότητας της Νa+,Κ+-ΑΤΡάσης, η οποία πιθανώς να υποδηλώνει την ύπαρξη μιας περιοχικά-ειδικής μεταβολής της δραστικότητας του ενζύμου αυτού, η οποία μπορεί να οφείλεται στην διαφορετική ιστολογική νεύρωση και λειτουργικότητα των υπό μελέτη εγκεφαλικών δομών. Τέλος, η σημαντική αύξηση που παρατηρήθηκε στην δραστικότητα της Mg2+-ATPάσης στoν ιππόκαμπο των ηλικίας 21 ημερών απογόνων, αποτελεί ένα εύρημα που παρατηρείται για πρώτη φορά στη σχετική βιβλιογραφία, αφού πολύ λίγα στοιχεία είναι γνωστά ως σήμερα σχετικά με την επίδραση της μητρικής έκθεσης σε EtOH στην δραστικότητα της Mg2+-ATPάσης στον εγκέφαλο των απογόνων (τα υπάρχοντα διαθέσιμα ευρήματα αφορούν κυρίως επιδράσεις της έκθεσης σε EtOH στην περίοδο ενηλικίωσης). Επιπρόσθετα, η αύξηση στην δραστικότητα της Mg2+-ATPάσης στoν ιππόκαμπο των ηλικίας 21 ημερών απογόνων, μπορεί να: (i) δρα σαν ένας δείκτης για την συγκεκριμένη εγκεφαλική δομή, αναφορικά με την νευροτοξικότητα που προκαλέι το FASD, ή/και (ii) αποτελέι μια προσπάθεια των κυτάρων της συγκεκριμένης εγκεφαλικής δομής να αυξήσουν τον ρυθμό πρωτεϊνοσύνθεσης, επιταχύνοντας με αυτόν τον τρόπο την κυτταρική ανάπτυξη με απώτερο στόχο να ξεπεράσουν την εν δυνάμει (δομική) νευροαναπτυξιακή καθυστέρηση την οποία επάγει η έκθεση σε EtOH. Παρά τα προαναφερθέντα αξιοσημείωτα ευρήματα, περαιτέρω πειραματική έρευνα απαιτείται μελλοντικά με στόχο τη προσομοίωση και την διελεύκανση της παθοφυσιολογίας ηπιότερων μορφών FASD. Στη 2η πειραματική φάση, ιδιαίτερο ενδιαφέρον αποτελεί η παρατηρούμενη αύξηση στην δραστικότητα της AChE στον ολικό εγκέφαλο των νεογέννητων επιμύων της ομάδας TDD1, συγκριτικά με την ομάδα Control1, η οποία πιθανώς να οφείλεται σε έναν ή περισσότερους από τους παρακάτω μηχανισμούς: i) η ικανότητα της T να δρα σαν αναστολέας της δραστικότητας της AChE in vitro, αλλά και να μπλοκάρει την διαβίβαση νευρικών ερεθισμάτων in vivo, πιθανώς να σχετίζεται με τη μειώση της φυσιολογικής αναστολής της δραστικότητας της AChE, ii) πιθανώς η TD να επηρεάζει το χολινεργικό σύστημα (συνεπώς και την δραστικότητα της AChE), διαμέσω των πολύπλοκων και σε μεγάλο βαθμό αδιευκρίνιστων συνεργειακών αλληλεπιδράσεων μεταξύ των διαφορετικών εγκεφαλικών νευροδιαβιβαστικών συστημάτων, και iii) η παρατηρούμενη αύξηση της δραστικότητας της AChE στην ομάδα TDD1 πιθανώς να αποτελεί μία προσπάθεια του χολινεργικού συστήματος να αντισταθμίσει τα μειωμένα επίπεδα νευροδιαβίβασης (εξαιτίας των κυτταρικών μεταβολών από την TD), από την συσσώρευση ROS στον εγκέφαλο κατά την προγεννητική έκθεση σε TD. Επιπρόσθετα, η παρατηρούμενη επαναφορά της δραστικότητα της AChE στον ολικό εγκέφαλο της ομάδας TDD21 στα φυσιολογικά επίπεδα, πιθανώς να οφείλεται στην επαναπρόσληψη ικανής ποσότητας T, διαμέσω του θηλασμού, η οποία και τελικώς να αποκαθιστά την ομαλή χολινεργική λειτουργία. Στις ομάδες συνχορήγησης, η παρατηρούμενη μείωση της δραστικότητας της AChE στην ομάδα TDD21+EtOH21, πιθανώς να οφείλεται στην μείωση των εγκεφαλικών επιπέδων TPP εξαιτίας των συνεργικών νευροτοξικών επιδράσεων της έκθεσης σε EtOH, σε συνδυασμό με την κατάσταση TD εξαιτίας της χορήγησης TDD. Επιπλέον, η σημαντική μείωση η οποία διαπιστώθηκε στη δραστικότητα της AChE στον ολικό εγκέφαλο της ομάδας συνχορήγησης TDD21+EtOH21, όταν αυτή συγκρίθηκε με την ομάδα TDD21, καταδεικνύει το γεγονός ότι οι νευροτοξικές επιδράσεις από την συνχορήγηση είναι εντονότερες, συγκριτικά με αυτές που μπορεί να προκαλέσει η κατάσταση TD από μόνη της. Αναφορικά με την δραστικότητα της Νa+,Κ+-ΑΤΡάσης, η παρατηρούμενη μείωση στην ομάδα TDD1 των νεογέννητων επιμύων, συγκριτικά με την ομάδα Control1, πιθανώς να οφείλεται στη μειωμένη σύνθεση ATP που προκαλείται από την διαταραχή του καταβολισμου των νευρικών κυττάρων εξαιτίας των μειωμένων εγκεφαλικών επιπέδων της TPP σε κατάσταση TD. Αντίθετα, η παρατηρούμενη αύξηση στη δραστικότητα της Νa+,Κ+-ΑΤΡάσης στην ομάδα EtOH1, συγκριτικά με την ομάδα Control1, πιθανώς να σχετίζεται με την εκτεταμένη απελευθέρωση γλουταμινικού οξέος, προκαλώντας νευρωνική βλάβη εξαιτίας της επαγόμενης υπερδιέργερσης. Στις ομάδες συνχορήγησης EtOH και TDD, τόσο στους νεογέννητους, όσο και στους 21 ημερών απογόνους, η παρατηρούμενη σημαντική αύξηση στη δραστικότητα της Νa+,Κ+-ΑΤΡάσης στον ολικό εγκέφαλο, συγκριτικά με τις αντίστοιχες ομάδες Control, πιθανώς να οφείλεται στη μιτοχονδριακή δεισλειτουργία, την επαγόμενη απώλεια ενέργειας, στην πρόκληση οξειδωτικού στρες εξαιτίας του σχηματισμού ROS, στις διαταραχές κατά τον κυτταρικό πολλαπλασιασμο και τη κυτταρική μετανάστευση, και τελικά στο κυτταρικό θάνατο, στο ευπρόσβλητο στάδιο της ανάπτυξης του νευρικού συστήματος. Σχετικά με την ιδιαίτερα σημαντική αύξηση στη δραστικότητα της Νa+,Κ+-ΑΤΡάσης στον ολικό εγκέφαλο των νεογέννητων επιμύων της ομαδας συνχορήγησης ΤDD1+EtOH1, συγκριτικά με την ομάδα TDD1, μπορούμε να συμπαιράνουμε ότι οι νευροτοξικές επιδράσεις της χορήγησης EtOH υπερισχύουν αυτών που προκαλούνται από την TD, οδηγώντας τελικά σε αύξηση της δραστικότητας της Νa+,Κ+-ΑΤΡάσης στον ολικό εγκέφαλο της ομαδας συνχορήγησης ΤDD1+EtOH1. Η δραστικότητα της Mg2+-ATPάσης στον ολικό εγκέφαλο, τόσο των νεογέννητων, όσο και των ηλικίας 21-ημερών απογόνων, δε παρουσίασε καμία μεταβολή σε όλες τις υπο μελέτη ομάδες. Τέλος, μπορούμε να συμπαιράνουμε ότι όταν η in utero χορήγηση της EtOH πραγματοποιείται σε ήπιες δόσεις, όπως στη παρούσα διατριβή, δεν προκαλούνται σημαντικές μεταβολές στην ιστοπαθολογική εικόνα του ήπατος, τόσο κατά την γέννηση, όσο και μετά το πέρας της γαλουχίας