Επίδραση Ειδικών Πρωτεολυτικών Ενζύμων Στην Εξωσωματική Παραγωγή Και Στα Ποιοτικά Χαρακτηριστικά Των Εμβρύων Αγελάδων

Abstract

Στην παρούσα διατριβή μελετάται η επίδραση της τροποποίησης των in vitro υποστρωμάτων της γονιμοποίησης (IVF) και της καλλιέργειας των εμβρύων (IVC) με την προσθήκη του ενεργοποιού του πλασμινογόνου του ιστικού τύπου (t-PA) και του τύπου της ουροκινάσης (u-PA) αντίστοιχα, στα ποσοστά παραγωγής των βλαστοκύστεων, αλλά και στην ποιότητά τους, αναλύοντας την έκφραση μιας σειράς γονιδίων που συνδέονται με την ικανότητα ενός εμβρύου να επιβιώσει ή να διακόψει την ανάπτυξή του. Στα υποστρώματα της IVF και της IVC προσδιορίσθηκε η δραστηριότητα των ενεργοποιών του πλασμινογόνου (PAA) και των αδρανοποιών τους (PAI) με τη βοήθεια φασματοφωτομετρικής μεθόδου. Στο 1ο πείραμα χρησιμοποιήθηκαν 2016 συμπλέγματα ωαρίων-κυττάρων του ωοφόρου δίσκου (COCs), τα οποία χωρίστηκαν στην ομάδα των μαρτύρων [control], στην ομάδα της οποίας τα υποστρώματα τροποποιήθηκαν με προσθήκη t-PA, τελική δραστηριότητα 500 IU/ml [t-PA], στην ομάδα που εκτός από t-PA περιείχε και τον αναστολέα ε-αμινοκαπροϊκό οξύ (ε-ACA) [t-PA+ε-ACA], και στην ομάδα που περιείχε μόνο ε-ACA [ε-ACA]. Το 2ο πείραμα περιλαμβάνει δύο υποκατηγορίες πειραμάτων, όπου η επίδραση της προσθήκης του u-PA, σε τελική δραστηριότητα 5 IU/ml, μελετήθηκε σε απογυμνωμένα έμβρυα, τα οποία καλλιεργήθηκαν σε ημι-καθορισμένες συνθήκες (πείραμα 2.α, συνολικά 1631 πιθανά ζυγωτά) και σε έμβρυα, τα οποία καλλιεργήθηκαν σε μη-καθορισμένες συνθήκες και με την παρουσία μίας μονοστιβάδας κυττάρων του ωοφόρου δίσκου (πείραμα 2.β, συνολικά 629 πιθανά ζυγωτά). Η αξιολόγηση της ποιότητας των παραγόμενων βλαστοκύστεων ημέρας 7 έγινε με τη συγκριτική μελέτη της έκφρασης των γονιδίων PLAC8, AKR1B1, BIRC5 ή survivin, BBC3 ή PUMA, PΤGS-2 ή COX-2, BCL2L1, SLC2A5 ή GLUT-5, MnSOD, PLG και PLAUR, των οποίων η έκφραση μεταβάλλεται ανάλογα με την ποιότητα των εμβρύων. Για την γονιδιακή ανάλυση των μοριδίων ημέρας 3 και 4 ελέγχθηκαν τα γονίδια BAX, BCL2L1, PIPOX, G6PD, SLC2A5, MnSOD και KAT2B ή PCAF. Tα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής δείχνουν ότι η προσθήκη εξωγενούς t-PA στο υπόστρωμα της IVF προκαλεί μείωση των ποσοστών αυλάκωσης και παραγωγής εμβρύων βοοειδών. Όταν η εξωγενής αυτή PAA μειώνεται με την προσθήκη του αναστολέα ε-ACA, τα αποτελέσματα της IVP επανέρχονται στα φυσιολογικά επίπεδα. Από την ανάλυση της έκφρασης των επιλεγμένων γονιδιακών μαρτύρων αποκαλύφθηκε ότι, η τροποποίηση με την προσθήκη εξωγενούς t-PA ενδεχομένως επηρεάζει αρνητικά και την ποιότητα των παραγόμενων πρώιμων εμβρύων, καθώς σε αυτά βρέθηκαν να επάγονται φαινόμενα, όπως η απόπτωση και η διακοπή του κυτταρικού κύκλου. Από την άλλη πλευρά, στο 2ο πείραμα, η τροποποίηση του υποστρώματος καλλιέργειας των εμβρύων με προσθήκη u-PA, δεν επηρέασε την εξωσωματική παραγωγή και την ποιότητα των εμβρύων βοοειδών, είτε αυτά καλλιεργήθηκαν απογυμνωμένα από τη στιβάδα των κυττάρων του ωοφόρου δίσκου και σε υπόστρωμα ημι-καθορισμένων συνθηκών, είτε σε συγκαλλιέργεια σε μονοστιβάδα κυττάρων του ωοφόρου δίσκου και παρουσία ορού. Μολονότι η προσθήκη των δύο ενεργοποιών του πλασμινογόνου στα υποστρώματα της IVP δεν ευνόησε τα ποσοστά παραγωγής των εμβρύων βοοειδών, καθώς και την ποιότητα αυτών, αλλά αντιθέτως τα δυσχέραινε στην πρώτη πειραματική διαδικασία, περισσότερα πειράματα απαιτούνται για τη διαλεύκανση του επακριβούς ρόλου του συστήματος στην IVP. Σε κάθε περίπτωση προκύπτει ότι, οι δυο ενεργοποιοί αποτελούν παράγοντες που συμμετέχουν στη γονιμοποίηση και στην ανάπτυξη των εμβρύων, καθιστώντας ιδιαίτερα ενδιαφέρουσα την αναζήτηση των πιθανών μηχανισμών δράσης και των αλληλεπιδράσεων τους κατά τη διάρκεια των παραπάνω διαδικασιών.