Ιστολογική Ανάπτυξη Εξατομικευμένου Χόνδρινου Εμφυτεύματος Από Ανθρώπινα Μεσεγχυματικά Βλαστικά Κύτταρα Λιπώδους Ιστού, Σε Τρισδιάστατο Εκτυπωμένο Ικρίωμα Με Χρήση Προηγμένων Μεθόδων Κατασκευής CAD/CAM Και Βιοαντιδραστήρα

Abstract

Στην παρούσα Διατριβή χρησιμοποιήθηκε η τεχνολογία ‘προσθετικής κατασκευής’ (Additive Manufacturing) και συγκεκριμένα η μοντελοποίηση με απόθεση τήξης (FDM) και τρισδιάστατη εκτύπωση (3D printing) για την κατασκευή τρισδιάστατων τυπωμένων ικριωμάτων πολυκαπρολακτόνης διαφορετικών γεωμετρικών πόρων και μικρο-αρχιτεκτονικής δομής. Παρουσιάστηκε μια συγκριτική ανάλυση ανάπτυξης υαλοειδούς χόνδρου από διαφοροποιημένα μεσεγχυματικά κύτταρα προερχόμενα από ανθρώπινο λιπώδη ιστό (hADMSCs) σε τρία διαφορετικά και πρωτότυπα ικριώματα στην εσωτερική δομή τους. Αξιολογήθηκε ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων, ο εποικισμός και η διαφοροποίησή τους, σε σχέση με τη δομή του κάθε ικριώματος, καθώς και οι μηχανικές ιδιότητες των τελικών κατασκευών. Ιδιαίτερη έμφαση δόθηκε τόσο στην μάκρο- όσο και στην μίκρο-αρχιτεκτονική, για την βέλτιστη χονδρογενή διαφοροποίηση, ως μία σημαντική παράμετρος που δεν έχει μελετηθεί καλά στη βιβλιογραφία. Μεταξύ των τριών ικριωμάτων που δοκιμάστηκαν, το RO45 ήταν ευνοϊκότερο για χονδρογενή διαφοροποίηση, ενώ το 3DHC υποστήριξε καλύτερα τον πολλαπλασιασμό και την διείσδυση των κυττάρων εντός του ικριώματος, παρουσιάζοντας επίσης και τον υψηλότερο ρυθμό αύξησης στις μηχανικές ιδιότητες του τελικού αναγεννημένου χόνδρινου ιστού. Προσδιορίστηκε επίσης το πιο ευνοϊκό περιβάλλον για την ιδανικότερη υποστήριξη του πολλαπλασιασμού και της διαφοροποίησης των κυττάρων. Για το σκοπό αυτό, χρησιμοποιήθηκε βιοαντιδραστήρας διάχυσης (perfusion bioreactor) που προσελκύει συνεχώς την προσοχή των ερευνητών ως ένα αποτελεσματικό και σύγχρονο εργαλείο στη μηχανική ιστών. Επίσης εφαρμόστηκε ένα φυσικό βιοϋλικό ευρέως διαδεδομένο στην Αναγεννητική Ιατρική, με εξαιρετική βιοσυμβατότητα, βιοαποικοδομησιμότητα και μη τοξικά χαρακτηριστικά. Πρόκειται για το κολλαγόνο, μια δομική πρωτεΐνη με αδιαμφισβήτητα ευεργετικά χαρακτηριστικά. Η μελέτη εκτελέστηκε σε τρισδιάστατα εκτυπωμένα ικριώματα πολυκαπρολακτόνης που παρασκευάστηκαν με τετράγωνους πόρους. Το κολλαγόνο είτε εφαρμόστηκε μεμονωμένα και επικάλυψε τις ίνες του ικριώματος, είτε εφαρμόστηκε ως ένα διάλυμα γέλης κολλαγόνου και κύτταρων που συνολικά διείσδυσε στους πόρους των ικριωμάτων. Χρησιμοποιήθηκαν επιπλέον δύο διαφορετικά μέσα διαφοροποίησης για τον έλεγχο της χονδρογενούς διαφοροποίησης σε όλα τα ικριώματα, σε συνθήκες στατικής και δυναμικής καλλιέργειας με βιοαντιδραστήρες διάχυσης. Στη δυναμική καλλιέργεια, τα κύτταρα στα ικριώματα χωρίς την προσθήκη κολλαγόνου είχαν καλύτερη διείσδυση και πιο ομοιόμορφη κατανομή εντός του ικριώματος. Αυτά δε που συνδυάστηκαν με το μέσο χονδρογενούς διαφοροποίησης βασισμένο στον αυξητικό παράγοντα TGF-β2, έδειξαν επαυξημένη χονδρογενή διαφοροποίηση που οφείλονταν στο ευεργετικό μηχανικό ερέθισμα της δυναμικής καλλιέργειας. Περαιτέρω, μελετήθηκε η αρχική προσκόλληση των κυττάρων στα τρισδιάστατα ικριώματα, για να επιτευχθεί υψηλή πυκνότητα κυττάρων και ακόμη πιο ομοιόμορφη κατανομή κυττάρων, που γενικά θεωρείται μια πρόκληση σε εφαρμογές Ιστομηχανικής. Για τον σκοπό αυτό σχεδιάστηκε, κατασκευάστηκε και μελετήθηκε μια πρωτότυπη συσκευή τρισδιάστατης καλλιέργειας κυττάρων (3D-CD) για στατική καλλιέργεια με γνώμονα τον περιορισμό απώλειας κυττάρων κατά την έγχυση και την διευκόλυνση παροχής θρεπτικών ουσιών. Η τεχνολογία τρισδιάστατης εκτύπωσης (3D printing) χρησιμοποιήθηκε τόσο για το ικρίωμα όσο και για την κατασκευή της συσκευής καλλιέργειας. Εκτός από τη δοκιμή της συσκευής, ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να εκτιμηθούν και να συγκριθούν οι στατικές και δυναμικές μέθοδοι έγχυσης και οι συνθήκες καλλιέργειας των κυττάρων, υπό κανονικές και υποξικές συνθήκες (normoxia and hypoxia) και τα αποτελέσματά τους σε παραμέτρους όπως η αποτελεσματικότητα διασποράς των κυττάρων, η κατανομή των κυττάρων και ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων. Η συσκευή καλλιέργειας (3D-CD) βελτίωσε την αποτελεσματικότητα έγχυσης των κυττάρων με σχεδόν μηδαμινή απώλεια κυττάρων και με ομοιόμορφο εποικισμό σε όλες τις ζώνες του ικριώματος, όπως αναδείχθηκε από τις χρησιμοποιούμενες τεχνικές σάρωσης με μικροτομογράφο (micro-CT). Σε επόμενη φάση αξιολογήθηκε η περαιτέρω διαφοροποίηση των μεσεγχυματικών κυττάρων με αυτή την συσκευή και σε συνθήκες νορμοξίας ή υποξίας. Η μέθοδος διαφοροποίησης στην πρωτότυπη συσκευή σε συνδυασμό με τις συνθήκες υποξίας είχε ως αποτέλεσμα την αναγέννηση ιστού χόνδρου με ιδανικά χαρακτηριστικά όπως άφθονη εξωκυττάρια θεμέλια ουσία (ECM) πλούσια σε γλυκοζαμινογλυκάνες και πρωτεογλυκάνες, αλλά επίσης και αρκετά αυξημένη αναλογία σε κολλαγόνο τύπου ΙΙ έναντι του κολλαγόνου τύπου Ι, όπως και στο φυσιολογικό υαλοειδή χόνδρο. Τέλος, αξίζει να σημειωθεί ότι οι μηχανικές ιδιότητες που προέκυψαν μπορούν να αντέξουν ακόμη και τις πιο ακραίες συνθήκες της καθημερινής καταπόνησης των αρθρώσεων.