Λειτουργική Ανάλυση Του Γονιδίου FRA10AC1 Του Ανθρώπου Στο Πλαίσιο Του Δικτύου Πρωτεϊνικών Αλληλεπιδράσεων Του Σωματίου Συναρμογής

Abstract

Το γονίδιο FRA10AC1 εντοπίζεται στην σπάνια εύθραυστη χρωμοσωματική θέση FRA10A, η οποία επάγεται απουσία φυλλικού οξέος στο θρεπτικό μέσο καλλιέργειας των κυττάρων, στην χρωμοσωματική περιοχή 10q23.3 του ανθρώπου. Η FRA10A αποτελεί την πιο συχνά εμφανιζόμενη σπάνια εύθραυστη θέση στο γονιδίωμα του ανθρώπου με συχνότητα που εκτιμάται στους 1/500. Οι φορείς της FRA10Α εμφανίζουν νοητική και αναπτυξιακή υστέρηση, όπως δυσμορφικά χαρακτηριστικά, μικρό ανάστημα, υποσπαδία και δυσχέρεια λόγου. Η μοριακή βάση της κυτταρογενετικής εμφάνισής της είναι η επέκταση, κατά τουλάχιστον ~200 φορές, τρινουκλεοτιδικών επαναλήψεων του τύπου (CGG)n που εντοπίζονται στην 5’ μη μεταφραζόμενη περιοχή του γονιδίου FRA10AC1. Αυτή η επέκταση οδηγεί στην υπερμεθυλίωση της περιοχής αυτής και στη μεταγραφική καταστολή του αντίστοιχου αλληλομόρφου. Το γονίδιο FRA10AC1 είναι μεταγραφικά ενεργό σε όλους τους ιστούς ενήλικων ατόμων παρουσιάζοντας υψηλότερα επίπεδα έκφρασης στον εγκέφαλο, την καρδιά, τους σκελετικούς μύες και το ήπαρ. Το κύριο μετάγραφο του γονιδίου FRA10AC1 κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη 315 αμινοξέων που εμφανίζει αποκλειστικά πυρηνική τοπολογία. Η FRA10AC1 είναι μια συντηρημένη πρωτεΐνη καθώς εμφανίζει ορθόλογα μόρια σε πλήθος ευκαρυωτικών, πολυκύτταρων ή μονοκύτταρων οργανισμών, αλλά όχι σε προκαρυωτικούς οργανισμούς. Έχει ταυτοποιηθεί επανειλημμένα ως συστατικό του μείζονος σωματίου συναρμογής και των επιμέρους υποσυμπλόκων του, B act (activated), C και P. Επίσης, έχει δειχθεί, με γενετικά πειράματα στο φύκος Chlamydomonas reinhardtii, ότι συνεισφέρει στην αναγνώριση των θέσεων συναρμογής, και με διαφορετικές πειραματικές μεθόδους, ότι αλληλεπιδρά με συστατικά του σωματίου συναρμογής (DGCR14, SF3B2). Βάσει των παραπάνω υποδεικνύεται η συμμετοχή της στις διαδικασίες επεξεργασίας του mRNA. Με στόχο την κατανόηση του λειτουργικού ρόλου της FRA10AC1 έγινε, αρχικά, η ανασύσταση του δικτύου πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεών της και, ακολούθως, ολόκληρου του σωματίου συναρμογής. Για την ανακατασκευή των δικτύων χρησιμοποιήθηκε η μεταβάση PICKLE η οποία περιλαμβάνει καταχωρήσεις από πέντε βάσεις δεδομένων πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων του ανθρώπου, καθώς και οι βάσεις δεδομένων DroID και Worm Interactome Database που περιλαμβάνουν πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις από τους οργανισμούς-μοντέλα, D. melanogaster και C. elegans. Πραγματοποιήθηκε η ανάκτηση των δεδομένων που αφορούσαν μόνο άμεσες πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις με βασικό κριτήριο, στην περίπτωση του δικτύου του σωματίου συναρμογής, τη βιοχημική ταυτοποίηση των πρωτεϊνών ως συστατικά του ριβονουκλεοπρωτεϊνικού αυτού συμπλόκου. Η ανάλυση των τοπολογικών παραμέτρων του δικτύου του σωματίου συναρμογής και της γονιδιακής οντολογίας της ευρύτερης «γειτονιάς» της FRA10AC1 συνεισέφερε στην εξαγωγή συμπερασμάτων σχετικά με την πιθανή βιολογική λειτουργία της FRA10AC1. Παράλληλα, δημιουργήθηκε ένα κυτταρικό μοντέλο HeLa με μόνιμα κατεσταλμένη την έκφραση του γονιδίου FRA10AC1, μέσω της χρήσης κλώνων shRNA που στοχεύουν στη κωδική περιοχή του ενδογενούς γονιδίου. Στο κυτταρικό μοντέλο εφαρμόστηκαν ομικές προσεγγίσεις στα τρία βασικά επίπεδα κυτταρικής λειτουργίας (μεταγραφικό, πρωτεϊνικό, μεταβολικό) ώστε να ελεγχθούν οι επιδράσεις που προκαλούσε η καταστολή της έκφρασης του γονιδίου στην κυτταρική φυσιολογία. Η μελέτη των αλλαγών αυτών στο πλαίσιο του δικτύου πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων του σωματίου συναρμογής αλλά και εκτός αυτού συνεισέφερε στην ανάπτυξη προτεινόμενων μοντέλων λειτουργίας της FRA10AC1 εντός του σωματίου συναρμογής.