Μελέτη Κοινοτήτων Συμβιωτικών Βακτηρίων Σε Έντομα Αγροτικής Και Περιβαλλοντικής Σημασίας

Abstract

Τα τελευταία χρόνια οι γνώσεις μας σχετικά με τον ρόλο των ενδοσυμβιωτικών βακτηρίων στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς-ξενιστές τους, έχουν αυξηθεί σε τέτοιο βαθμό ώστε να γνωρίζουμε πλέον ένα πλήθος από λειτουργίες στις οποίες συμμετέχουν, επηρεάζοντας σε μεγάλο βαθμό σημαντικές πτυχές της βιολογίας, οικολογίας και εξέλιξης των ξενιστών τους. Τα ενδοσυμβιωτικά βακτήρια επιδρούν στην ανάπτυξη και τη διατροφή, στην αναπαραγωγή και την ειδογένεση, στην επικοινωνία, στην προστασία ενάντια σε φυσικούς εχθρούς, παθογόνους μικροοργανισμούς και παράσιτα, στην αντοχή σε ακραίες περιβαλλοντικές συνθήκες και στον ρόλο των εντόμων σαν φορείς μολυσματικών ασθενειών για τον άνθρωπο και τα ζώα. Οι λειτουργίες αυτές μας επιτρέπουν να βελτιώσουμε την εφαρμογή καινοτόμων τεχνικών, με μικρό περιβαλλοντικό αντίκτυπο, για την αντιμετώπιση εντόμων που δρουν σαν εχθροί καλλιεργειών ή φορείς μολυσματικών ασθενειών. Οι μύγες των γενών Bactrocera, Dacus και Zeugodacus αποτελούν σημαντικούς εχθρούς καλλιεργούμενων φυτικών ειδών, με ικανότητα να προσβάλλουν μεγάλο αριθμό διαφορετικών φρούτων και λαχανικών, τα οποία χρησιμοποιούν κυρίως για την εκπλήρωση του βιολογικού τους κύκλου, κατά την ανάπτυξη των προνυμφών τους. Αν και πολλά είδη κατάγονται από περιοχές της νοτιοανατολικής Ασίας και της Αφρικής, έχουν επεκτείνει σε μεγάλο βαθμό την κατανομή τους σε πολλές τροπικές, υποτροπικές και εύκρατες περιοχές του πλανήτη, εκτοπίζοντας γηγενείς πληθυσμούς μυγών, ενώ με την συνεχή αύξηση της θερμοκρασίας, τους παρουσιάζονται συνεχώς νέες ευκαιρίες εξάπλωσης. Για την αντιμετώπισή τους χρησιμοποιούνται ευρέως χημικά εντομοκτόνα, τα οποία εμφανίζουν πολύπλευρες αρνητικές συνέπειες στο περιβάλλον, τον άνθρωπο και τα ζώα, ενώ με το πέρασμα του χρόνου η εφαρμογή τους καθίσταται αναποτελεσματική λόγω ανάπτυξης αντίστασης από τα έντομα-στόχους. Σκοπός της παρούσας Διατριβής είναι η εκμετάλλευση του συμβιωτικού βακτηριακού φορτίου των συγκεκριμένων εντόμων με σκοπό την ανάπτυξη ή και βελτίωση περιβαλλοντικά φιλικότερων τεχνικών που αποσκοπούν στον έλεγχο των πληθυσμών τους. Τέτοιες τεχνικές, όπως η τεχνική στείρου εντόμου (Sterile Insect Technique, SIT), που χρησιμοποιεί ιονίζουσα ακτινοβολία για την στείρωση και μαζική απελευθέρωση εντόμων, και η τεχνική ασύμβατου εντόμου (Incompatible Insect Technique, IIT), που χρησιμοποιεί συμβιωτικά βακτήρια που προκαλούν αναπαραγωγικές αλλοιώσεις στα έντομα-ξενιστές τους, αποτελούν πολλά υποσχόμενες τεχνολογίες προς αυτή την κατεύθυνση. Η εφαρμογή καινοτόμων τεχνολογιών απαιτεί συνεχώς παραγωγή νέας γνώσης στην κατεύθυνση της βελτίωσής τους, της μείωσης των ατελειών και των μειονεκτημάτων τους. Συγκεκριμένα, η ιονίζουσα ακτινοβολία επιδρά στην αρμοστικότητα των εντόμων, με συνέπεια την μειωμένη ανταγωνιστικότητα των μαζικά εκτρεφόμενων εντόμων σε σύγκριση με τα άτομα των άγριων πληθυσμών. Σε αυτή την περίπτωση, συμβιωτικά βακτήρια μπορούν να χρησιμοποιηθούν στην παρεχόμενη τροφή για την βελτίωση της αρμοστικότητας των μαζικά εκτρεφόμενων εργαστηριακών στελεχών και κατά συνέπεια της αποδοτικότητας της τεχνικής. Από την άλλη μεριά, για τον σχεδιασμό αλλά και την καλύτερη εφαρμογή της τεχνικής ασύμβατου εντόμου, είναι σημαντική η γνώση των πολυποίκιλων αλληλεπιδράσεων μεταξύ των διαφορετικών ειδών βακτηρίων που προκαλούν αναπαραγωγικές αλλοιώσεις (αναπαραγωγικά παράσιτα), μεταξύ των διαφορετικών στελεχών ενός αναπαραγωγικού παρασίτου, καθώς και των αναπαραγωγικών παρασίτων με το έντομο-ξενιστή. Συγκεκριμένα, στην παρούσα Διατριβή, ελέγχθηκε η παρουσία τεσσάρων συμβιωτικών βακτηρίων, των Wolbachia, Spiroplasma, Cardinium και Arsenophonus τα οποία περιέχουν στελέχη που προκαλούν αναπαραγωγικές αλλοιώσεις, σε 14 είδη μυγών που ανήκουν στα γένη Bactrocera, Dacus και Zeugodacus που συλλέχθηκαν από 30 φυσικούς πληθυσμούς, με καταγωγή από τρεις χώρες της νοτιοανατολικής Ασίας, καθώς και από 19 εργαστηριακούς πληθυσμούς. Συνολικά αναλύθηκαν 801 ενήλικα άτομα από φυσικούς πληθυσμούς και 380 άτομα από εργαστηριακές αποικίες. Τα αποτελέσματα στους φυσικούς πληθυσμούς έδειξαν πολύ μεγάλη απόκλιση στην εμφάνιση και τη σχετική συχνότητα των συμβιωτικών βακτηρίων ανά είδος, πληθυσμό και χώρα. Συνολικά οι μολύνσεις με Wolbachia ήταν οι επικρατέστερες, ακολουθούμενες από γένη των Entomoplasmatales και είδη Cardinium, ενώ δεν παρατηρήθηκαν μολύνσεις με είδη Arsenophonus. Αντίθετα, οι εργαστηριακοί πληθυσμοί δεν περιείχαν μολύνσεις με τα συμβιωτικά βακτήρια. Ο μοριακός χαρακτηρισμός των συμβιωτικών βακτηρίων απέδειξε ότι τα περισσότερα κατατάσσονταν σε κοινή φυλογενετική ομάδα, γεγονός που υποδηλώνει οριζόντια μεταφορά συμβιωτικών βακτηρίων μεταξύ διαφορετικών ειδών. Σε τρία είδη (B. correcta, Β. dorsalis και B. zonata) παρατηρήθηκαν μολύνσεις με πολλαπλά στελέχη του βακτηρίου Wolbachia. Τέλος, αναγνωρίστηκαν περιπτώσεις ψευδογονιδίων της Wolbachia, ορισμένα από τα οποία ήταν όμοια με ψευδογονίδια που εντοπίστηκαν προηγουμένως σε άλλα έντομα-ξενιστές, στα οποία μάλιστα είχαν βρεθεί ενσωματωμένα στο γονιδίωμά τους. Επίσης, πραγματοποιήθηκε έλεγχος της επίδρασης ιονίζουσας ακτινοβολίας στη σύσταση των βακτηριακών κοινοτήτων ενήλικων αρσενικών και θηλυκών μυγών του είδους Zeugodacus cucurbitae που αναπτύσσονται μαζικά στο εργαστήριο. Η επίδραση της ακτινοβολίας μελετήθηκε σε συνάρτηση με την δίαιτα που εφαρμόστηκε στο προνυμφικό στάδιο, καθώς και το φύλο των μυγών. Μελετήθηκε η επίδραση δύο διαφορετικών διατροφών: μιας συνθετικής με βάση άλευρα πιτύρου και μιας φυσικής από κολοκύθα. Αρχικά, παρατηρήθηκαν διαφορές στις βακτηριακές κοινότητες των εντόμων πριν την εφαρμογή ακτινοβολίας, τόσο μεταξύ μυγών που είχαν αναπτυχθεί σε διαφορετικές δίαιτες, καθώς και μεταξύ ατόμων διαφορετικού φύλου. Μετά την επίδραση ακτινοβολίας, οι βακτηριακές κοινότητες σημείωσαν στατιστικά σημαντική διαφοροποίηση στις μύγες που αναπτύχθηκαν με την συνθετική δίαιτα, εμφανίζοντας επίσης στατιστικά σημαντική μείωση στην αφθονία και την ποικιλότητα, ενώ το βακτηρίωμα των δειγμάτων που αναπτύχθηκαν με τον φυσικό ξενιστή παρέμεινε σχεδόν αναλλοίωτο. Αλλαγές στη σύνθεση των βακτηριακών κοινοτήτων, αλλά μικρότερης κλίμακας, παρατηρήθηκαν και μεταξύ ατόμων διαφορετικού φύλου, με τα αρσενικά άτομα να εμφανίζουν επίσης στην πλειοψηφία τους μεγαλύτερη ποικιλότητα ενώ τα θηλυκά μεγαλύτερη αφθονία. Τόσο τα αρσενικά όσο και τα θηλυκά άτομα εμφάνισαν μικρότερη ή ίδια ποικιλότητα και αφθονία μετά την επίδραση ακτινοβολίας, με εξαίρεση τα θηλυκά άτομα που αναπτύχθηκαν με κολοκύθα, στα οποία παρατηρήθηκε αύξηση και στα δύο χαρακτηριστικά. Ομοίως, έγινε έλεγχος της επίδρασης ιονίζουσας ακτινοβολίας στην δομή των βακτηριακών κοινοτήτων ενήλικων αρσενικών και θηλυκών ατόμων τους είδους Bactrocera dorsalis από εργαστηριακούς πληθυσμούς. Μελετήθηκαν διαφορές στη σύσταση των βακτηριακών κοινοτήτων ανάλογα με το αναπτυξιακό στάδιο στο οποίο βρίσκονται οι μύγες (προνυμφικό στάδιο και ενήλικες) καθώς και στις ενήλικες μετά την επίδραση ιονίζουσας ακτινοβολίας. Αρχικά, δεν παρατηρήθηκαν διαφορές στους δείκτες ποικιλότητας και αφθονίας, μεταξύ ενηλίκων μυγών και προνυμφών, ενώ τα δύο αναπτυξιακά στάδια που μελετήθηκαν ανέπτυξαν διαφορετικά βακτηριακά προφίλ. Τα ενήλικα άτομα μετά την ακτινοβόληση εμφάνισαν υψηλότερους δείκτες ποικιλότητας και αφθονίας σε σχέση με τα ενήλικα δείγματα που δεν ακτινοβολήθηκαν, ενώ οι δύο κατηγορίες εμφάνισαν και στατιστικά σημαντική διαφοροποίηση στη σύσταση του βακτηριακού τους προφίλ. Τέλος, γίνεται σχολιασμός της προοπτικής χρησιμοποίησης των αποτελεσμάτων της παρούσας Διατριβής με σκοπό τη βελτίωση ή ανάπτυξη τεχνικών στείρου και ασύμβατου εντόμου για την αντιμετώπιση των συγκεκριμένων ειδών εντόμων. Επίσης σχολιάζονται οι οικολογικές και εξελικτικές προεκτάσεις των μολύνσεων με συμβιωτικά βακτήρια στους φυσικούς πληθυσμούς από την νοτιοανατολική Ασία.