Μελέτη Της Δομικής Και Λειτουργικής Αλληλεπίδρασης Πυρηνικών Πρωτεϊνών Κάτω Από Υποξία Και Άλλες Στρεσογόνες Συνθήκες

Abstract

O παράγοντας SAFB1 (Scaffold Attachment Factor B) είναι πρωτεΐνη της πυρηνικής μήτρας και απομονώθηκε πριν από είκοσι περίπου χρόνια με βάση το χαρακτηριστικό του να προσδένεται σε στοιχεία S/MAR (Scaffold/Matrix Attachment Region) του DNA. Ο SAFB1 με τον εξελικτικά συγγενή του SAFB2, έχουν μεταξύ τους ομολογία 74% και αποτελούν αντικείμενο έρευνας της παρούσας διδακτορικής διατριβής. Αποτελούνται από την περιοχή πρόσδεσης στο DNA, SAF-box στο αμινοτελικό τους άκρο, την περιοχή δέσμευσης με το RNA, RRM, ενώ στο καρβοξυτελικό τους άκρο έχουν μια περιοχή πλούσια σε επαναλήψεις Arg-Glu (R/E) που ακολουθείται από μια περιοχή πλούσια σε κατάλοιπα Arg και Gly (R, G), υπεύθυνη για τις γνωστές ως τώρα πρωτεϊνικές τους αλληλεπιδράσεις. Στο πρώτο μέρος της διατριβής εξετάστηκε η ικανότητα πρόσδεσης των SAFB στη χρωματίνη μέσω της αμινοτελικής τους περιοχής, υπό την επίδραση δυο μεταβολικών στρεσσογόνων συνθηκών, της υποξίας και της στέρησης γλυκόζης. Για κάθε συνθήκη εξετάστηκαν τα πρωτεϊνικά επίπεδα και ο υποκυτταρικός εντοπισμός τους. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι και οι δύο συνθήκες δεν επηρεάζουν τον υποκυτταρικό εντοπισμό τους αλλά τα πρωτεϊνικά επίπεδά τους. Συγκεκριμένα, η υποξία αυξάνει τα πρωτεϊνικά επίπεδα των SAFB1/2 όχι όμως στο επίπεδο της μεταγραφής και με μηχανισμό ανεξάρτητο των μεταγραφικών παραγόντων HIFs (Hypoxia-inducible factors), αλλά προκαλώντας αύξηση του διαλυτού κλάσματός τους στο πυρηνόπλασμα. Επίσης η υποξία δεν επηρέασε την δράση τους ως συγκαταστολείς της μεταγραφικής ενεργότητας του ERα (Estrogen Receptor α). Αντίθετα, η στέρηση γλυκόζης φάνηκε να μειώνει τα πρωτεϊνικά επίπεδα των SAFB1/2, χωρίς όμως να αποκλείεται αυτό να συμβαίνει στο επίπεδο της μεταγραφής.Στο δεύτερο μέρος διερευνήθηκαν οι λειτουργίες των SAFB μέσω δύο αλληλεπιδράσεων που έχουν βρεθεί στο εργαστήριο Βιοχημείας και συμβαίνουν με το καρβοξυτελικό τους άκρο. Η πρώτη αλληλεπίδραση είναι με την κινάση SRPK1 (Serine/Arginine Protein Kinase 1). Καταρχάς εξετάστηκε δομικά, όπου με πειράματα χρωματογραφίας αγχιστείας εντοπίστηκε για πρώτη φορά, ότι τα 180 C-τελικά αμινοξέα της SRPK1(473-655) είναι ικανά και απαραίτητα για την αλληλεπίδραση της με τον SAFB1. Επίσης, διερευνήθηκε λειτουργικά, μέσω εύρεσης συνθηκών όπου τα δύο μόρια SAFB και SRPK1, τα οποία κατά τ’ άλλα έχουν διαφορετικές υποκυτταρικές κατανομές, είναι πιθανόν να βρεθούν σε κοινό υποκυτταρικό εντοπισμό. Εξετάστηκαν τα πρωτεϊνικά επίπεδα και ο υποκυτταρικός εντοπισμός της SRPK1 υπό την επίδραση της υποξίας, του οσμωτικού στρες, της στέρησης αμινοξέων και της στέρησης γλυκόζης. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι καμία από τις τέσσερις συνθήκες δεν ήταν ικανή να μεταβάλλει τα πρωτεϊνικά επίπεδα της SRPK1, ενώ μόνο οι συνθήκες του οσμωτικού στρες και της στέρησης γλυκόζης προκάλεσαν μια υποκυτταρική μετατόπιση της SRPK1, σε διακριτές πυρηνικές δομές. Η δεύτερη αλληλεπίδραση που εξετάστηκε ήταν με την πρωτεΐνη ERH (Enhancer of Rudimentary Homologue), η οποία εμπλέκεται σε ποικίλες βασικές κυτταρικές διεργασίες μεταξύ των οποίων και το μάτισμα. Με πειράματα ανοσοκατακρήμινσης και χρωματογραφίας αγχιστείας βρέθηκε ότι η ERH αλληλεπιδρά άμεσα μέσα σε κύτταρα θηλαστικών μέσω των 205 καρβοξυτελικών αμινοξικών καταλοίπων των SAFB, ενώ από πειράματα ανοσοφθορισμού και βιοχημικής κλασμάτωσης δείχθηκε ότι οι δυο πρωτεΐνες συν-εντοπίζονται στην πυρηνική μήτρα. Τέλος, η ERH δεν μεταβάλλει τη λειτουργία των SAFB1/2 ως συγκαταστολείς του υποδοχέα των οιστρογόνων ERα αλλά αναιρεί την καταστολή που προκαλούν στην ενζυμική δράση της SRPK1, λογικό επακόλουθο του γεγονότος ότι SRPK1και ERH προσδένονται στην ίδια επικράτεια των SAFB1/2.Συνολικά τα παραπάνω ευρήματα θα βοηθήσουν στην εμβάθυνση και την κατανόηση των λειτουργιών των SAFB1/2 και των μοριακών παρτενέρ τους, οι οποίοι εμπλέκονται σε βασικές κυτταρικές διεργασίες όπως είναι η οργάνωση της χρωματίνης, ο μεταβολισμός του RNA και η μεταγραφή.