Μελετη Του Πολυενζυμικου Συστηματος Βιοσυνθεσης Και Αποικοδομησης Σιαλογλυκοπρωτεινων Σε Προκαρυωτικα Και Ευκαρυωτικα Κυτταρα

Abstract

Α Θεραπευτικός ρόλος 62 Β. Βιομηχανικές εφαρμογές 63 Γ. Χρήση των γαλακτικών βακτηρίων σαν εργαστηριακό υλικό μελέτης 64 Αντικείμενο μελε'τηβ 65 2. ΥΛΙΚΑ -ΜΕΘΟΔΟΙ 2.1 Υλικά 66 2.2 Οργανα 67 2.3 Παρασκευαστικές μέθοδοι 68 2.3.1 Μικροοργανισμοί, συνθήκες καλλιέργειας 68 2.3.2 Απομόνωση σιαλικών οξέων 2.3.3 Καθαρισμός σιαλικών οξέων 2.3.4 Απομόνωση του ενζύμου CMP-σιαλυλ-τρανσφεράσης 2.3.5 Καθαρισμός της CMP-σιαλυλ-τρανσφεράσης 2.3.6 Απομόνωση πλασμιδιακού DNA από το στέλεχος Lactobacillus plantarum BAU 2.3.7 Απομόνωση πλασμιδιακού DNA από το στέλεχος Escherichia coli HBIOI 73 2.3.8 Καθαρισμός πλασμιδίων 2.3.9 Τροποποίηση του στελέχους Escherichia coli HBIOI * 2.3.10 Επιλογή τροποποιημένων κλώνων E. coli ΗΒ101 2.3.11 Σταθερότητα πλασμιδίων 75 2.3.12 Απομόνωση των επιφανειακών κυτταρικών γλυκοπρωτεινών τον στελέχους L. plantarum ΒΑ11 2.3.13 Απομόνωση γλυκολιπιδίων και πολυσακχαριτών από το στέλεχος L. plantarum BAU , 75 2.3.14 Ενσωμάτωση της WGA λεκτίνης σε στήλη 4B-Sepharose 75 2.3.15 Καθαρισμός του επιφανειακού σιαλυλ-γλυκοπρωτεινικού μορίου . 76 2.4 Αναλυτικές μέθοδοι 2.4.1 Μέτρηση βιομάζας 2.4.2 Προσδιορισμός σιαλικών οξέων 2.4.3 Ενσωμάτωση NeuAc σε κύτταρα L. plantarum BAU 78 2.4.4 Ενσωμάτωση CMP-NeuAc σε κύτταρα L. plantarum ΒΑ11 2.4.5 Επίδραση NeuSAc στην ενσωμάτωση CMP-Neu5Ac 2.4.6 Εντοπισμός NeuAc ή CMP-NeuAc στα κύτταρα L. plantarum BAU 2.4.7 Κινητικές μελέτες της πορείας ενσωμάτωσης NeuAc από τα βακτηριακά κύτταρα 79 2.4.8 Επίδραση μονοσακχαριτών και προδρόμων μορίων στην ενσωμάτωση NeuSAc : 80 2.4.9 Επίδραση ενεργοποιητών και αναστολέων στην ενσωμάτωση Neu5Ac 80 2.4.10 Προσδιορισμός ενζυμικής δραστικότητας της NeuAc-αλδολάσης 81 2.4.11 Προσδιορισμός ενζνμικής δραστικότητας της CMP-NeuAc-συνθάσης 82 2.4.12 Προσδιορισμός ενζυμικής δραστικότητας της CMP-NeuAc-νδρολάσης 82 2.4.13 Προσδιορισμός ενζυμικής δραστικότητας της CMP-NeuAc-τρανσφεράσης 83 2.4.14 Προσδιορισμός πρωτεϊνών 84 2.4.15 Κινητικές μελέτες της CMP-σιαλυλ-τρανσφεράσης 85 2.4.16 Επίδραση ενεργοποιητών και αναστολέων στην δραστικότητα της CMPσιαλυλ-τρανσφεράσης 85 2.4.17 Προσδιορισμός του μοριακού βάρους των πρωτεϊνών της CMP-σιαλυλ-τρανσφεράσης και του σιαλυλιωμένου γ&κοπρωτεινικού μορίου 86 2.4.18 R/ίθετη ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών σε πήκτωμα ακρυλαμιδίου . Α. Παρουσία SDS Β. Μη αποδιατακτική (native) ηλεκτροφόρηση (απουσία SDS) 2.4.19 Κάθετη ηλεκτροφόρηση γλυκοπρωτεινών σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου 89 2.4.20 Χρώση σακχαρικών καταλοίπων γλυκοπρωτεινών σε πήκτωμα πολυ ακρυλαμιδίου με PAS 89 2.4.21 Μέτρηση πλασμιδιακού DNA 2.4.22 Οριζόντια ηλεκτροφόρηση πλασμιδιακού DNA σε πήκτωμα αγαρόζης 2.4.23 Μέθοδος προσδιορισμού σακχάρων 3. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 3.1 Παρουσία σιαλικών οξέων στο στέλεχος Lactobacillus plantarum BAU 3.1.1 Απομόνωση και ταυτοποίηση σιαλικών οξέων στο στέλεχος L. plantarum BAU 3.1.2 Εντοπισμός των σιαλικών οξέων στην επιφάνεια των κυττάρων L. plantarum BAU 3.1.3 Βιοσύνθεση σιαλικών οξέων σε συνάρτηση με την φάση ανάπτυξης των κυττάρων 3.2 Μελέτες ενσωμάτωσης εξωγενούς Neu5Ac στο στέλεχος L. plantarum BAU 3.2.1 Ενσωμάτωση εξωγενούς NeuSAc στο ...