Μηχανισμοί Αναγέννησης Του Μυοκαρδίου

Abstract

Οι μυοκαρδιοπάθειες αποτελούν την κυριότερη αιτία θανάτου παγκοσμίως, οδηγώντας στην πλειονότητα των περιπτώσεων σε καρδιακή ανεπάρκεια. Δυστυχώς, η εφαρμογή κάποιας θεραπευτικής μεθόδου δεν είναι πάντοτε εφικτή, ειδικά στις περιπτώσεις καρδιακής ανεπάρκειας, όπου απαιτείται η μεταμόσχευση καρδιάς. Η ανακάλυψη προγονικών κυττάρων στο ενήλικο μυοκάρδιο, καθώς και ότι η ενήλικη καρδιά διαθέτει μια μικρή αναγεννητική ικανότητα, αποτέλεσε ένα σπουδαίο επίτευγμα για την ανάπτυξη νέων θεραπευτικών μεθόδων με σκοπό την αντιμετώπιση και τη θεραπεία των καρδιακών παθήσεων. Προς αυτή την κατεύθυνση, έχει πραγματοποιηθεί πληθώρα ερευνών τις τελευταίες δύο δεκαετίες, όπου μελετήθηκαν τα χαρακτηριστικά και η διαφοροποιητική ικανότητα των ενήλικων καρδιακών προγονικών κυττάρων. Παρόλο που τα πειραματικά αποτελέσματα τις πλείστες φορές είναι αρκετά αισιόδοξα ως προς την αναγεννητική τους ικανότητα, το ποσοστό επιτυχίας είναι πολύ μικρό, γεγονός το οποίο δυσχεραίνει τη χρήση τους σε κλινικό επίπεδο. Η συγκεκριμένη παρατήρηση, μάλιστα, έχει ξεκινήσει ένα μακροσκελή επιστημονικό διάλογο ως προς την ενδογενή ικανότητα διαφοροποίησης των καρδιακών προγονικών κυττάρων προς μυοκαρδιοκύτταρα, ο οποίος στηρίζεται στον ακριβέστερο χαρακτηρισμό τους. Στόχος της παρούσας Διδακτορικής Διατριβής ήταν η απομόνωση και ο χαρακτηρισμός των ενήλικων προγονικών κυττάρων της καρδιάς που εκφράζουν τον φαινότυπο του «Παράπλευρου Πληθυσμού» (Cardiac Side Population, CSP), καθώς και των κυττάρων που εκφράζουν στην επιφάνειά τους τον δείκτη Sca1 (Sca1+) από το μοντέλο ποντικού με έλλειψη δεσμίνης.Η δεσμίνη, η οποία αποτελεί την κύρια πρωτεΐνη των Ενδιάμεσων Ινιδίων (Intermediate Filaments, IF) των μυϊκών κυττάρων και τον πιο πρώιμο μυϊκό δείκτη, έχει δειχθεί ότι διαδραματίζει σημαντικό ρόλο κατά τη διαφοροποίηση των εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων προς μυϊκά κύτταρα, ενώ εκφράζεται και στον προγονικό πληθυσμό των CSP κυττάρων της καρδιάς ενήλικων ποντικών. Λαμβάνοντας υπ’ όψιν τη σπουδαιότητα της δεσμίνης στη διασφάλιση της σωστής ανάπτυξης και λειτουργιάς των μυοκαρδιοκυττάρων (απουσία της παρατηρούνται βλάβες των μιτοχονδρίων, έντονος κυτταρικός θάνατος και ανάπτυξη Διατατικής Μυοκαρδιοπάθειας), τόσο κατά την ανάπτυξη, όσο και κατά τα ενήλικα στάδια, προκύπτει η υπόθεση ότι ενδεχομένως να εμπλέκεται και στην εμφάνιση των χαρακτηριστικών των CSP και Sca1+ προγονικών κυττάρων με άμεσο αντίκτυπο στην αναγεννητική τους ικανότητα.Με σκοπό να απαντηθούν τα παραπάνω ερωτήματα, ενήλικα CSP και Sca1+ κύτταρα απομονώθηκαν από καρδιές ποντικών με έλλειψη δεσμίνης (des-/-) και αγρίου τύπου (wt) και αρχικά, χαρακτηρίστηκαν γονιδιακά ως προς την έκφραση γονιδίων δεικτών των καρδιακών κυττάρων για τον προσδιορισμό του χαρακτήρα τους και του αναπτυξιακού σταδίου-βαθμού διαφοροποίησης στο οποίο βρίσκονται. Παράλληλα, καθώς τα CSP κύτταρα συνιστούν έναν ετερογενή πληθυσμό, χαρακτηρίστηκαν και φαινοτυπικά ως προς την έκφραση δεικτών της κυτταρικής επιφάνειας με σκοπό τον προσδιορισμό του ρόλου της δεσμίνης στους διάφορους CSP υποπληθυσμούς. Από τα πειράματα που πραγματοποιήθηκαν, βρέθηκε ότι σε αντίθεση με τα Sca1+ κύτταρα, το ποσοστό των οποίων δεν σημείωσε διαφορές μεταξύ των δύο γενοτύπων, η απουσία της δεσμίνης επηρεάζει τόσο το ποσοστό των ολικών CSP κυττάρων, ο οποίος ήταν σημαντικά αυξημένος στα des-/- ποντίκια σε σχέση με τα wt, όσο και διάφορους υποπληθυσμούς των CSP κυττάρων. Η παρατηρούμενη αυτή αύξηση, βρέθηκε να μην σχετίζεται με την επίδραση της δεσμίνης άμεσα στον πολλαπλασιασμού των CSP κυττάρων, καθώς οι διαφορές στην έκφραση γονιδίων δεικτών του κυτταρικού κύκλου που παρατηρούνται αμέσως μετά την απομόνωση των CSP κυττάρων, συνθήκη που αντικατοπτρίζει την in vivo κατάσταση, εξαλείφονται κατά την παραμονή των κυττάρων στην καλλιέργεια, ενώ ταυτόχρονα, και ο ρυθμός πολλαπλασιασμού των κυττάρων in vitro δεν σημείωσε διαφορές μεταξύ των δύο γενοτύπων. Αντίθετα, η δεσμίνη φαίνεται να διαδραματίζει έναν έμμεσο ρόλο στον πολλαπλασιασμό των CSP κυττάρων μέσω του μικροπεριβάλλοντος και των συνθηκών που επικρατούν στο des-/- μυοκάρδιο, όπως είναι η ίνωση, η φλεγμονή και ο θάνατος των μυοκαρδιοκυττάρων, καθώς στα des-/- ποντίκια ηλικίας 15 ημερών στα οποία δεν έχει εμφανισθεί ακόμα ο παθολογικός φαινότυπος, αλλά και στο μοντέλο ποντικού με έλλειψη δεσμίνης στο οποίο έχει γίνει αναστροφή του des-/- φαινοτύπου μετά από υπερέκφραση της πρωτεΐνης αΒ-κρυσταλλίνης, το ποσοστό των CSP κυττάρων δεν παρατηρείται αυξημένο σε σχέση με τα αντίστοιχα wt ποντίκια. Κατά το γονιδιακό χαρακτηρισμό των CSP και Sca1+ κυττάρων, παρατηρήθηκε ότι τα κύτταρα αυτά εκφράζουν δείκτες των καρδιακών προγονικών κυττάρων, αλλά όχι των διαφοροποιημένων μυοκαρδιοκυττάρων. Επίσης, βρέθηκε ότι η έλλειψη δεσμίνης εμπλέκεται στην έκφραση των καρδιακών μεταγραφικών παραγόντων Mef2c και Nkx2.5, τα επίπεδα των οποίων ήταν σημαντικά μειωμένα αμέσως μετά την απομόνωσή τους ή μετά από παραμονή σε καλλιέργεια, αντίστοιχα, συγκριτικά με τα wt, γεγονός το οποίο συνηγορεί υπέρ του ρόλου της δεσμίνης στον καρδιακό καθορισμό των CSP και Sca1+ κυττάρων.Με σκοπό να διερευνηθεί περαιτέρω ο ρόλος της δεσμίνης στη διαφοροποίηση των CSP και Sca1+ προς μυοκαρδιοκύτταρα, πραγματοποιήθηκε επαγωγή της διαφοροποίησης με τη χρήση του αναστολέα των μεθυλοτρανσφερασών, 5-αζακυτιδίνη. Παρατηρήθηκε ότι τα des-/- CSP κύτταρα παρουσίασαν μειωμένη έκφραση του γονιδίου Nkx2.5 σε σχέση με τα wt, ενώ τα des-/- Sca1+ κύτταρα παρουσίασαν μειωμένη έκφραση του γονιδίου Myh6, γεγονότα τα οποία, αφενός, υποδεικνύουν ότι η δεσμίνη εμπλέκεται με διαφορετικό τρόπο στη διαφοροποίηση των δύο κυτταρικών τύπων και, αφετέρου, ότι ο ρόλος της έγκειται κυρίως στον πρώιμο καθορισμό των κυττάρων προς μυοκαρδιοκύτταρα. Ωστόσο, με τη συγκεκριμένη μεθοδολογία δεν παρατηρήθηκε ικανοποιητική διαφοροποίηση των κυττάρων προς μυοκαρδιοκύτταρα, καθώς σε πρωτεϊνικό επίπεδο δεν ανιχνεύθηκε έκφραση κανενός από τους δείκτες των ώριμων μυοκαρδιοκυττάρων. Προκειμένου να παρακαμφθεί το παραπάνω εμπόδιο και να γίνει πλήρης αποσαφήνιση του ρόλου της δεσμίνης στη διαφοροποίηση, ακολουθήθηκε μια εναλλακτική πειραματική προσέγγιση, κατά την οποία πραγματοποιήθηκε επαγωγή της διαφοροποίησης των Sca1+ κυττάρων μετά από υπερέκφραση των καρδιακών μεταγραφικών παραγόντων Gata4, Mef2c και Tbx5 (GMT), οι οποίοι μπορούν να επάγουν τον επαναπρογραμματισμό των καρδιακών ινοβλαστών απευθείας σε μυοκαρδιοκύτταρα. Από τα αποτελέσματα προέκυψε ότι η δεσμίνη επηρεάζει σε επίπεδο mRNA μόνο την έκφραση του γονιδίου Myh6 κατά την διαφοροποίηση των Sca1+ κυττάρων, η οποία ήταν σημαντικά μειωμένη στα des-/- κύτταρα συγκριτικά με τα wt, ενώ σε πρωτεϊνικό επίπεδο, ομοίως με παραπάνω, δεν παρατηρήθηκαν διαφορές στην έκφραση πρωτεϊνών των ώριμων μυοκαρδιοκυττάρων. Όπως προκύπτει από τα παραπάνω, ο ρόλος της δεσμίνης στα χαρακτηριστικά των προγονικών κυττάρων φαίνεται να περιορίζεται in vivo, κυρίως μέσω των γεγονότων που ακολουθούν την απουσία της. Καθώς πλήθος μελετών υποδεικνύουν ότι συνθήκες παρόμοιες με αυτές που επικρατούν στο des-/- μυοκάρδιο εμπλέκονται στη γήρανση των προγονικών κυττάρων, μελετήθηκε εάν η απουσία της δεσμίνης επηρεάζει τη γήρανση των CSP και Sca1+ κυττάρων, γεγονός το οποίο θα είχε αρνητικό αντίκτυπο στην ικανότητα διαφοροποίησής τους και, κατ’ επέκταση, στην περαιτέρω χρήση τους σε κλινικές μελέτες με σκοπό την αποκατάσταση βλαβών του μυοκαρδίου. Τα αποτελέσματα που προέκυψαν από τον έλεγχο έκφρασης δεικτών γήρανσης, της μέτρησης του μήκους των τελομερών, καθώς και του προσδιορισμού των γερασμένων κυττάρων με τη χρήση του αντιδραστηρίου Sentragor, υπέδειξαν ότι η απουσίας της δεσμίνης επηρεάζει την έκφραση του δείκτη p16INK4α από τα Sca1+ κύτταρα, χωρίς όμως τη συσχέτιση του μήκους των τελομερών ή την επαγωγή της γήρανσης των Sca1+ κυττάρων. Συμπεραίνεται ότι ο ρόλος της δεσμίνης στους CSP και Sca1+ προγονικούς πληθυσμούς της καρδιάς των ενήλικων ποντικών, περιορίζεται κυρίως στον πρώιμο καθορισμό τους προς μυοκαρδιοκύτταρα και όχι τόσο στην τελική διαφοροποίησή τους, γεγονός το οποίο επιβεβαιώνεται και από μελέτες διαφοροποίησης στα εμβρυικά βλαστικά κύτταρα. Το παραπάνω εύρημα είναι σπουδαίας σημασίας για την ανάπτυξη νέων βελτιωμένων μεθοδολογιών με σκοπό την αποτελεσματικότερη διαφοροποίηση των προγονικών κυττάρων στοχευμένα προς μυοκαρδιοκύτταρα, αντί άλλων τύπων καρδιακών κυττάρων, καθώς η περιορισμένη διαφοροποίησή τους προς μυοκαρδιοκύτταρα αποτελεί το μείζον πρόβλημα κατά τη χρήση τους σε κλινικές μελέτες, το οποίο έχει πυροδοτήσει, μάλιστα, μεγάλο διάλογο αμφισβήτησης στην επιστημονική κοινότητα.