Ρύθμιση της έκφρασης και λειτουργία του θερμοεπαγόμενου γονιδίου hsp27 στη μεσογειακή μύγα, Ceratitis capitata

Abstract

ΠερίληψηΈνας συντηρημένος μηχανισμός κυτταρικής απόκρισης στο θερμικό και άλλα είδη στρες είναι η σύνθεση των θερμοεπαγόμενων πρωτεϊνών (Hsps) (reviewed by Morimoto et al., 1994). Οι Hsps αποτελούν μοριακούς συνοδούς, με κύριο ρόλο την πρόσδεσή τους σε μερικώς αποδιαταγμένες πρωτεΐνες εμποδίζοντας έτσι την συσσωμάτωσή τους (reviewed by Hartl and Hayer-Hartl, 2002). Οι Hsps κατηγοριοποιούνται σε διακριτές οικογένειες σύμφωνα με τα μοριακά τους βάρη. Η υπεροικογένεια των μικρών θερμοεπαγόμενων πρωτεϊνών (sHsps)-α κρυσταλλίνης, περιλαμβάνει πρωτεΐνες με μοριακό βάρος που ποικίλει μεταξύ 12-43 kDa. Κύρια χαρακτηριστικά τους είναι η ύπαρξη μιας πολύ συντηρημένης επικράτειας της α-κρυσταλλίνης στο καρβoξυτελικό τους άκρο, περίπου 80-100 αμινοξικών καταλοίπων και η ικανότητά τους να δημιουργούν δυναμικά ολιγομερή, πάνω από 800 kDa (reviewed by de Jong et al., 1998, MacRae, 2000, Nakamoto and Vígh, 2007). Εκτός από τον ρόλο τους στην προστασία των κυττάρων σε καταστάσεις στρες, συμμετέχουν και σε μια πλειάδα άλλων κυτταρικών λειτουργιών (reviewed by Arrigo, 1998, MacRae, 2000, Mounier and Arrigo, 2002, Arrigo, 2005, Garrido et al., 2012). Επίσης, πολλές μελέτες επισημαίνουν τη συμμετοχή των sHsps σε ανθρώπινες ασθένειες (reviewed by Boncoraglio et al., 2012, Kampinga and Garrido, 2012, Bakthisaran et al., 2015). Μία από τις πιο καλά μελετημένες sHsps είναι η Hsp27. Η Hsp27, εκτός από τον κύριο ρόλο της ως μοριακός συνοδός, εμπλέκεται και σε άλλες κυτταρικές λειτουργίες όπως η σταθεροποίηση του κυτταροσκελετού, ο πολυμερισμός της ακτίνης, η ανάπτυξη και διαφοροποίηση των κυττάρων και ο κυτταρικός θάνατος (reviewed by Arrigo et al., 2007, Lomiwes et al., 2014) καθώς και σε παθολογικές καταστάσεις (Kato et al., 1994, Plumier et al.,1997a, Currie et al., 2000, reviewed by Arrigo et al., 2007). Προκειμένου να γίνει ταυτοποίηση και να προσδιοριστεί ο ρόλος των στοιχείων που ρυθμίζουν την έκφραση του γονιδίου hsp27 της Μεσογειακής μύγας (Cchsp27) πραγματοποιήθηκε λειτουργική ανάλυση της 5΄ ανοδικής περιοχής του γονιδίου μέσω δημιουργίας διαγονιδιακών στελεχών. Για το γενετικό μετασχηματισμό της Μεσογειακής μύγας χρησιμοποιήθηκε το μεταθέσιμο γενετικό στοιχείο piggyΒac (Handler et al., 1998). Τα διαγονιδιακά στελέχη που δημιουργήθηκαν έφεραν το γονίδιο αναφοράς της λουσιφεράσης υπό τον έλεγχο διαφόρων αλληλουχιών της 5΄ ανοδικής περιοχής του γονιδίου. Τα αποτελέσματα των αναλύσεων έδειξαν πως η ευρύτερη 5΄ανοδική περιοχή του γονιδίου (-2808/+150) καθώς και η μικρότερη περιοχή (-1378/+150), οι οποίες περιέχουν και τα πέντε δυνητικά στοιχεία απόκρισης στη θερμότητα (HSEs), δίνουν την μεγαλύτερη θερμοεπαγωγή. Τα αποτελέσματα αυτά υποδηλώνουν πως τα πέντε HSEs που έχουν ταυτοποιηθεί στην περιοχή -1378/+150, είναι ικανά για μέγιστη θερμοεπαγωγή του γονιδίου. Επίσης, φαίνεται πως δεν υπάρχουν στην -2808/-1378 περιοχή άλλα στοιχεία που να παίζουν ρόλο στη ρύθμιση του γονιδίου από τη θερμότητα. Η περιοχή (-1122/+150) που περιλαμβάνει τα τρία πρώτα HSEs έδωσε χαμηλότερα θερμοεπαγόμενα επίπεδα έκφρασης από την περιοχή (-1378/+150), ενώ η περιοχή (-934/+150), που περιλαμβάνει μόνο τα δύο πρώτα HSEs, έδωσε περίπου ίδια θερμοεπαγόμενα επίπεδα έκφρασης με την περιοχή (-1378/+150) γεγονός που υποδηλώνει ότι το τρίτο HSE δεν φαίνεται να συμβάλει σημαντικά στη θερμοεπαγόμενη έκφραση του γονιδίου. Η περιοχή (-509/+150) που δεν περιλαμβάνει κανένα από τα πέντε HSEs του γονιδίου, έδωσε εντούτοις σημαντικά επίπεδα θερμοεπαγόμενης έκφρασης. Το γεγονός αυτό σε συνδυασμό με βιοπληροφορική ανάλυση αποκάλυψε την ύπαρξη άλλων δύο δυνητικών HSEs (α και β). Για να προσδιοριστούν τα ρυθμιστικά στοιχεία που ενέχονται στη επαγωγή του Cchsp27 γονιδίου από το ψυχρό στρες, μετρήθηκαν τα επίπεδα της λουσιφεράσης στα παραπάνω διαγονιδιακά στελέχη. Tα αποτελέσματα που πήραμε ήταν παρόμοια με εκείνα μετά από θερμικό στρες. Το γεγονός αυτό υποδηλώνει πως τα ίδια ρυθμιστικά στοιχεία (HSEs) επάγουν το γονίδιο τόσο στις υψηλές όσο και στις χαμηλές θερμοκρασίες.Προκειμένου να δούμε εάν υπάρχουν αλληλουχίες της 5΄ περιοχής του Cchsp27 γονιδίου που παίζουν κάποιο ρόλο στην έκφρασή του γονιδίου στις ωοθήκες σε φυσιολογικές συνθήκες, προσδιορίστηκε η ενεργότητα της λουσιφεράσης στις ωοθήκες των διαγονιδιακών στελεχών. Η ανάλυση έδειξε πως η 5΄ ανοδική περιοχή (-1378/-1122) περιέχει ενυσχητικά στοιχεία που επάγουν την έκφραση του γονιδίου, ενώ η περιοχή (-2808/-1378) του γονιδίου φαίνεται να περιέχει ένα ή περισσότερα ρυθμιστικά στοιχεία που καταστέλλουν την έκφρασή του.Σε φυσιολογικές συνθήκες, η έκφραση του γονιδίου Cchsp27, τόσο στο επίπεδο του mRNA όσο και στο επίπεδο της πρωτεΐνης, παρουσιάζει έντονες διακυμάνσεις κατά την ανάπτυξη του εντόμου, υποδηλώνοντας ότι η Ηsp27, εκτός από το ρόλο της ως μοριακού συνοδού, θα πρέπει να συνδέεται και με άλλες λειτουργίες κατά την ανάπτυξη των εντόμων.Προκειμένου να μελετηθεί η έκφραση της πρωτεΐνης Hsp27 στους ιστούς της Μεσογειακής μύγας, δημιουργήθηκε το διαγονιδιακό στέλεχος Cchsp27-gfp και η μελέτη έγινε με πειράματα συνεστιακής μικροσκοπίας φθορισμού. Τα αποτελέσματα από την έκφραση της Hsp27 στους διάφορους ιστούς της Mεσογειακής μύγας, δείχνουν ότι, σε φυσιολογικές συνθήκες, η πρωτεΐνη παρουσιάζει υψηλότερη έκφραση στους προνυμφικούς ιστούς από ότι στους ενήλικους ιστούς. Μετά από θερμικό στρες, η έκφραση της πρωτεΐνης είναι υψηλή τόσο στους προνυμφικούς όσο και στους ενήλικους ιστούς. Με εξαίρεση την επιδερμίδα της νύμφης, τους σιελογόνους αδένες της προνύμφης, τον δακτυλιοειδή αδένα του κεντρικού νευρικού συστήματος της προνύμφης και ορισμένους τύπους νευρώνων του κεντρικού νευρικού συστήματος του ενήλικου εντόμου, όπου η πρωτεΐνη εντοπίζεται και στον πυρήνα και στο κυτταρόπλασμα σε φυσιολογικές συνθήκες, σε όλους τους άλλους ιστούς και συστήματα (πεπτικό σύστημα, μαλπιγγιανά σωληνάρια, σιελογόνοι αδένες, λιπώδης ιστός, θωρακικοί μύες, αναπνευστικό σύστημα, εμβρυϊκοί δίσκοι, έμβρυο), η πρωτεΐνη εντοπίζεται μόνο στον πυρήνα, τόσο απουσία όσο και παρουσία θερμικού στρες. Τα αποτελέσματα αυτά, σε συνδυασμό με μελέτες στο έντομο Drosophila melanogaster (Michaud et al., 2008) όπου η Hsp27 έχει εντοπιστεί στα πυρηνικά κοκκία (nuclear speckles), μας επιτρέπει να υποθέσουμε πως ένας ρόλος της CcHsp27 στους πυρήνες θα μπορούσε να είναι η σταθεροποίηση των πυρηνικών συμπλόκων όπως αναφέρεται και παρακάτω.Κατά την ωογένεση, η πρωτεΐνη Hsp27 εκφράζεται σε όλα τα αναπτυξιακά στάδια με στάδιο-ειδικό και κύτταρο-ειδικό τρόπο. Στο γερμάριο, η πρωτεΐνη βρίσκεται στο κυτταρόπλασμα των σωματικών κυττάρων, σε φυσιολογικές συνθήκες αλλά και μετά από θερμικό στρες. Σε φυσιολογικές συνθήκες, στα πρώιμα στάδια της ωογένεσης, η πρωτεΐνη εντοπίζεται στην περιπυρηνική περιοχή των γεννητικών κυττάρων και στο κυτταρόπλασμα των επιθηλιακών κυττάρων, ενώ στα στάδια (9-10) εντοπίζεται στο κυτταρόπλασμα των γεννητικών κυττάρων. Στα πιο ώριμα στάδια (12-14) η πρωτεΐνη αλλάζει πρότυπο έκφρασης και εντοπίζεται στον πυρήνα των σωματικών κυττάρων. Μετά από θερμικό στρες, η πρωτεΐνη εντοπίζεται κυρίως στον πυρήνα των σωματικών κυττάρων σ’ όλη τη διάρκεια της ωογένεσης. Στη σπερματογένεση, σε φυσιολογικές συνθήκες, η πρωτεΐνη εντοπίζεται στον πυρήνα των πρόδρομων σπερματοκυττάρων και στους κώνους ακτίνης οι οποίοι βοηθούν στο διαχωρισμό των σπερματίδων. Μετά από θερμικό στρες, η πρωτεΐνη παρουσιάζει τον ίδιο κυτταρο-ειδικό εντοπισμό, ενώ εντοπίζεται επίσης και στους πυρήνες των επιθηλιακών κυττάρων των φερόντων αγωγών, των μακρών και βραχέων βοηθητικών αδένων και του βολβού εκσπερμάτισης. Τα αποτελέσματα της διατριβής αυτής, σε συνδυασμό με αποτελέσματα άλλων ερευνητών προτείνουν πως η Hsp27 της Μεσογειακής μύγας θα πρέπει να έχει σημαντική κυτταρο-ειδική λειτουργία, ειδικά στον πυρήνα των κυττάρων, συμβάλλοντας στη σταθερότητα και προστασία των πυρηνικών συμπλόκων αλλά και στη δυναμική και προστασία των ινιδίων της ακτίνης.