Σχεδιασμός, Έκφραση Και Δομικές Μελέτες Τμημάτων Του Ανθρώπινου Νευρωνικού Νικοτινικού Υποδοχέα Ακετυλοχολίνης

Abstract

Οι νικοτινικοί υποδοχείς ακετυλοχολίνης (nAChRs) ανήκουν στους υποδοχείς Cys-θηλιάς, που διαμεσολαβούν και ρυθμίζουν την ταχεία συναπτική νευροδιαβίβαση. Είναι πενταμερή κανάλια ιόντων που ενεργοποιούνται από προσδέτη και απαρτίζονται από πέντε ομόλογες υπομονάδες, καθεμία εκ των οποίων περιλαμβάνει μία αμινοτελική εξωκυττάρια περιοχή (ΕΚΠ), μια διαμεμβρανική περιοχή και μία κυτταροπλασματική περιοχή. Στις διεπαφές των ΕΚΠ των υπομονάδων του nAChR, εδράζεται η θέση πρόσδεσης του νευροδιαβιβαστή (ορθοστερική θέση), όπου μία α υπομονάδα συμμετέχει ως «κύρια» και η γειτονική της ως «συμπληρωματική». Μέχρι πρόσφατα, οι γνώσεις μας σχετικά με την δομή των νευρωνικών nAChRs προέρχονταν κυρίως από τον χαρακτηρισμό ομόλογων πρωτεϊνών. Η λεπτομερής γνώση της δομής τους αναμένεται να βοηθήσει καθοριστικά στην κατανόηση του μηχανισμού λειτουργίας τους, αλλά και στην ανάπτυξη φαρμάκων για την θεραπεία των διαταραχών με τις οποίες σχετίζονται, που συμπεριλαμβάνουν νευρολογικές και ψυχιατρικές διαταραχές τον εθισμό σε ουσίες, τη φλεγμονή και τον πόνο. Οι υπότυποι των nAChRs στους οποίους συμμετέχει η α9 υπομονάδα (α9*nAChRs) περιλαμβάνουν είτε ομοπενταμερείς α9 είτε ετεροπενταμερείς α9α10 υποδοχείς. Οι α9*nAChRs συγκεντρώνουν αυξανόμενο ενδιαφέρον, λόγω της εμπλοκής τους στην ρύθμιση πρώιμων διεργασιών της φλεγμονής, αλλά και επειδή έχουν αναδειχθεί ως υποσχόμενοι φαρμακευτικοί στόχοι, κυρίως για την θεραπεία του χρόνιου πόνου. Στην βιβλιογραφία, αναφέρονται δυσκολίες στην έκφραση της α9 υπομονάδας, που μετριάζονται, όταν αυτή συνεκφράζεται με την α10, ενώ δεν έχουν αναφερθεί περιπτώσεις που να επιτρέπουν αναλυτικές δομικές μελέτες. Καθώς η έκφραση και απομόνωση ολόκληρου του υποδοχέα έχει αποδειχθεί πρόκληση, στην παρούσα διατριβή, έγινε έκφραση και βιοχημική μελέτη επιμέρους περιοχών των α9*nAChRs. Με απώτερο στόχο να καταστεί δυνατή η δομική μελέτη τους, ακολουθήθηκαν δύο στρατηγικές, (α) έκφραση της α9-ΕΚΠ ή της α10-ΕΚΠ ως υδατοδιαλυτής πρωτεΐνης και (β) κατασκευή και έκφραση «κολοβών» μορφών των υποδοχέων, όπου έχουν απαλειφθεί τμήματα της κυτταροπλασματικής περιοχής. Η αγρίου τύπου α9-ΕΚΠ εκφράστηκε στον ζυμομύκητα Pichia pastoris και, μέσω χρωματογραφικών μεθόδων, απομονώθηκε ένας ομοιογενής πληθυσμός μονομερών της γλυκοπρωτεΐνης ή της ενζυμικά απογλυκοζυλιωμένης μορφής της. Η μονομερής α9-ΕΚΠ δεν περιλαμβάνει ολοκληρωμένη ορθοστερική θέση πρόσδεσης, ωστόσο ο φαρμακολογικός χαρακτηρισμός της έδειξε ότι, παρότι μονομερής, διατηρεί σε μεγάλο βαθμό την συγγένειά της για διάφορους υποκαταστάτες, σε σχέση με τους φυσικούς α9*nAChRs, ειδικά για τους ανταγωνιστές α-μπουγκαροτοξίνη (α-Bgtx), μεθυλ-λυκακονιτίνη (MLA) και d-τουμποκουραρίνη. Έτσι, αναδείχθηκε ο καίριος ρόλος της κύριας πλευράς της ορθοστερικής θέσης στην πρόσδεση υποκαταστατών. Από δοκιμές κρυστάλλωσης, λήφθηκαν κρύσταλλοι της απογλυκοζυλιωμένης α9-ΕΚΠ απουσία υποκαταστάτη ή παρουσία MLA ή α-Bgtx, που οδήγησαν, μετά από πειράματα περίθλασης ακτίνων-Χ, στην επίλυση της δομής της αποπρωτεΐνης α9-ΕΚΠ και των συμπλόκων της με MLA ή α-Bgtx, σε ανάλυση 1.8 Å, 1.7 Å και 2.7 Å, αντίστοιχα. Οι δομές αυτές αποτελούν τις πρώτες δομές που έχουν αναφερθεί για μια εξωκυττάρια περιοχή νευρωνικού nAChR. Η δομή της α9-ΕΚΠ, παρότι μονομερής και υδατοδιαλυτή, παρουσιάζει εντυπωσιακή ομοιότητα με ομόλογες πρωτεΐνες σε διαμόρφωση πενταμερούς, υποδεικνύοντας ότι η διαμόρφωσή της αντικατοπτρίζει αυτήν στους φυσικούς nAChRs. Στις δομές των συμπλόκων, ο προσανατολισμός των ανταγωνιστών σε σχέση με την α9-ΕΚΠ και το μοτίβο των αλληλεπιδράσεών τους είναι αντίστοιχα αυτών που παρατηρήθηκαν στα σύμπλοκά τους με ομόλογες πενταμερείς πρωτεΐνες, υπογραμμίζοντας περαιτέρω τον πρωταγωνιστικό ρόλο της κύριας πλευράς της ορθοστερικής θέσης στην πρόσδεση των υποκαταστατών. Η α10-ΕΚΠ (με μία μεταλλαγή, ώστε να ενισχυθεί η υδροφιλικότητα του μορίου) εκφράστηκε, σε P. pastoris, ως συσσωματώματα μεγάλου μοριακού βάρους και σε μικρό ποσοστό ως μονομερές, καθιστώντας την μη ελκυστική για δομικές μελέτες. Η έκφραση των μεμβρανικών κατασκευών της α9 σε βακτήρια, σε P. pastoris ή σε κύτταρα εντόμων (Sf9), αλλά και η συνέκφραση κολοβών μορφών των α9 και α10 σε Sf9, απέτυχαν να οδηγήσουν στην απομόνωση ενός σταθερού και ομοιογενούς πληθυσμού πενταμερών, όπως απαιτούν οι δομικές μελέτες. Μετά από σχεδιασμό και έκφραση σε Sf9, μιας κολοβής μορφής της α9 (α9Μ), με πιο μετριοπαθείς τροποποιήσεις στην κυτταροπλασματική περιοχή σε σχέση με τις προαναφερθείσες, επιτεύχθηκε η απομόνωση ενός σταθερού πληθυσμού πενταμερών, με ικανότητα πρόσδεσης της α-Bgtx, υποδεικνύοντας ότι οι διαλυτοποιημένοι υποδοχείς διατηρούν μερικώς την λειτουργικότητά τους. Η μεθοδολογία, που αναπτύχθηκε για την απομόνωση ομοπενταμερών υποδοχέων της α9Μ, θέτει τα θεμέλια για την δομική μελέτη διαμεμβρανικών α9 nAChRs είτε μέσω κρυσταλλογραφίας ακτίνων-Χ είτε με ηλεκτρονική κρυο-μικροσκοπία.