Σχέση Δομής - Λειτουργίας Της Απολιποπρωτεΐνης Α-Ι Του Ανθρώπου

Abstract

Η παρούσα διατριβή εστιάσθηκε στην ανάλυση της δομής και της λειτουργίας της αποΑ-Ι. Σκοπός της διατριβής ήταν να κατανοηθεί ο μηχανισμός με τον οποίο συγκεκριμένες λειτουργικές περιοχές και επιμέρους αμινοξέα της αποΑ-Ι συμβάλλουν στις φυσιολογικές της λειτουργίες όπως στην σύνδεση με φωσφολιπίδια, την ενεργοποίηση του ενζύμου Ακυλοτρανσφεράση της Λεκιθίνης-Χοληστερόλης (LCAT), την σύνδεση με τον υποδοχέα ΄καθαριστή' τάξης Β, τύπου Ι (SR-BI). Πραγματοποιήθηκε μεταλλαξιγένεση στο ανθρώπινο γονίδιο της αποΑ-Ι, και μετά από επιμόλυνση και επιλογή δημιουργήθηκαν σταθερές κυτταρικές σειρές που εκφράζουν τις μεταλλαγμένες μορφές της αποΑ-Ι. Oι μεταλλαγμένες πρωτεΐνες απομονώθηκαν από το μέσο καλλιέργειας και χρησιμοποιήθηκαν σε λειτουργικές και δομικές μελέτες. Τα πειράματα σύνδεσης των μεταλλαγμένων μορφών με το φωσφολιπίδιο Διμυριστοϋλ-φωσφατιδυλο-χολίνη (DMPC) έδειξαν ότι η καρβοξυτελική περιοχή της αποΑ-Ι είναι σημαντική για την αλληλεπίδραση της αποΑ-Ι με λιποσώματα φωσφολιπιδίων. Η απαλοιφή τμημάτων της καρβοξυτελικής περιοχής της πρωτεΐνης (αμινοξέα 167-243) (έλικες 7-10) αναστέλλει την αλληλεπίδραση των μεταλλαγμένων μορφών με λιποσώματα φωσφολιπιδίων. Αντίθετα η σημειακή αντικάσταση των αμινοξέων γλυκινών στις θέσεις 185 και 186 από προλίνες δεν επηρεάζει την ταχύτητα διαλυτοποίησης λιποσωμάτων φωσφολιπιδίων. Η μελέτη της ικανότητας ενεργοποίησης του ενζύμου LCAT από δισκοειδή σωματίδια ανασυγκροτημένης HDL, που περιέχουν τις μεταλλαγμένες μορφές έδειξε ότι σε σύγκριση με τον φυσικό τύπο της αποΑ-Ι οι μεταλλαγμένες μορφές (Δ165-175) και (G185>P, G186>P) μειώνουν την ενεργοποίηση του νεζύμου LCAT σε ποσοστό 60%. Οι μεταλλαγμένες μορφές (Δ187-197), (Δ185-243), (Δ198-243), (Δ220-243) και (Δ232-243) μειώνουν ακόμη περισσότερο την ενεργοποίηση σε ποσοστά 37-48 %. Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι η έλικα 7 καθώς και οι καρβοξυτελικές έλικες 8-10 είναι σημαντικές για την ενεργοποίηση του ενζύμου LCAT. Τα πειράματα διασύνδεσης έδειξαν ότι η καρβοξυτελική περιοχή της αποΑ-Ι συμμετέχει στον σχηματισμό ολιγομερών της πρωτεΐνης σε διάλυμα. Η απαλοιφή τμημάτων της καρβοξυτελικής περιοχής της αποΑ-Ι επιτρέπει τον σχηματισμό μικρής ποσότητας διμερών, αλλά εμποδίζει τον σχηματισμό τριμερών και τετραμερών, σε υψηλές συγκεντρώσεις σε διάλυμα.Τα πειράματα ραδιοσήμανσης και απομάκρυνσης του ραδιενεργού αμινοξέος έδειξαν ότι υπάρχει επιβράδυνση στην κινητική της έκκρισης των μεταλλαγμένων μορφών (Δ165-243) και (Δ175-243). Ο χρόνος ημίσσειας ζωής της ενδοκυττάριας μορφής της αποΑ-Ι για τις μεταλλαγμένες μορφές είναι περίπου διπλάσιος αυτού της αποΑ-Ι του φυσικού τύπου. Οι απαλοιφές των καρβοξυτερματικών αμινοξέων 165-243 ή 175-243 πιθανόν αποσταθεροποιούν την αποΑ-Ι μέσα στα κύτταρα και επιβραδύνουν την έκκρισή της. Στα πλαίσια της μελέτης της σύνδεσης της αποΑ-Ι στον υποδοχέα της HDL, SR-BI, αναπτύχθηκε μια νέα τεχνική την οποία ονομάσαμε τεχνική ανοσο-υποδοχέα. Η τεχνική αυτή μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως απλή και εναλλακτική μέθοδος για την εκτίμηση της πρόσδεσης συνδετών που περιέχουν αποΑ-Ι στον υποδοχέα SR-BI χωρίς να απαιτείται η ραδιοσήμανσή τους. Με την τεχνική αυτή η πρόσδεση του μη-ραδιοσημασμένου συνδέτη σε κύτταρα εκτιμάται με ποσοτική ανοσο-αποτύπωση. Η ανάλυση διαφόρων συνδετών έδειξε ότι δισκοειδή σωματίδια ανασυγκροτημένης HDL που περιέχουν αποΑ-Ι συνδέονται με υψηλή συγγένεια στον υποδοχέα SR-BI, ενώ η ελεύθερη αποΑ-Ι και η μορφή της πρε-β-1 HDL δεν εμφανίζουν SR-BI-εξαρτώμενη σύνδεση. Επιπλέον η αύξηση της πυκνότητας των σωματιδίων της σφαιρικής HDL μειώνει την συγγένεια σύνδεσης τους με τον υποδοχέα SR-BI. Η μελέτη της σύνδεσης των μεταλλαγμένων μορφών της αποΑ-Ι υπό την μορφή δισκοειδών σωματιδίων έδειξε ότι η ισχυρή σύνδεση των σωματιδίων στον υποδοχέα SR-BI μπορεί να επιτευχθεί με την κεντρική περιοχή του μορίου της αποΑ-Ι (αμινοξέα 60-184), σε συνδυασμό με είτε την καρβοξυτελική είτε την αμινοτελική περιοχή της πρωτεΐνης. Συνεπώς η αμινοτελική (1-59) και η καρβοξυτελική (185-243) περιοχή του μορίου της αποΑ-Ι επηρεάζουν με ανεξάρτητο μηχανισμό την σύνδεση στον υποδοχέα SR-BI, είτε άμεσα, είτε μέσω αλλαγών στην διαμόρφωση της κεντρικής περιοχής (αμινοξέα 60-184). Συμπερασματικά οι μελέτες επιβεβαιώνουν τον σημαντικό ρόλο της αποΑ-Ι στην σύνδεση της HDL στον υποδοχέα SR-BI. Οι μεταλλαγμένες μορφές της αποΑ-Ι θα χρησιμοποιηθούν στο μέλλον σε μελέτες που αφορούν την επιλεκτική μεταφορά εστέρων χοληστερόλης, μέσω του υποδοχέα SR-BI, την έξοδο χοληστερόλης από κύτταρα, την σύνδεση σε άλλους κυτταρικούς υποδοχείς, καθώς και σε in vivo μελέτες με μεταφορά μέσω αδενοϊών σε ποντίκια.