Ταυτοποίηση, φυλογένεση και καθορισμός των παραγόντων επικινδυνότητας των ειδών του γένους Cercopithifilaria, που προσβάλουν το σκύλο και τους κρότωνες στην Ελλάδα

Abstract

Τα είδη του γένους Cercopithifilaria, που προσβάλλουν τον σκύλο, δεν έχουν μελετηθεί εκτενώς μέχρι σήμερα, αν και έχουν διαπιστωθεί σποραδικά σε αρκετές χώρες. Η φιλαρίωση αυτή παρέμεινε για αρκετά χρόνια άγνωστη, λόγω της υποδόριας εντόπισης των ενηλίκων παρασίτων και της πρακτικής δυσκολίας ανίχνευσης των μικροφιλαριών (Otranto et al., 2013a). Ο βιολογικός κύκλος είναι έμμεσος, με ενδιάμεσο ξενιστή τους κρότωνες της οικογένειας Ixodidae (Winkhardt, 1980, Petit et al., 1988, Bain et al., 1986, Spratt and Haycock, 1988). Στο σκύλο έχουν ταυτοποιηθεί 3 είδη, τα Cercopithifilaria bainae, Cercopithifilaria grassi και Cercopithifilaria sp. II. Η παρουσία των ενηλίκων παρασίτων στον σκύλο και η εντόπιση των μικροφιλαριών στην επιδερμίδα, έχουν συσχετισθεί με διάφορες παθολογικές καταστάσεις όπως η δερματοπάθεια, υποδόρια κύστη και η αρθροπάθεια (Otranto et al., 2011a, Otranto et al., 2012a, Boyd et al., 2019, Soares et al., 2020a). Σήμερα, τα δεδομένα σχετικά με την Cercopithifilaria spp., που προσβάλλει τον σκύλο, είναι περιορισμένα παγκοσμίως. Στη χώρα μας το είδος Cercopithifilaria bainae έχει βρεθεί σε σκύλους σε μια πιλοτική έρευνα, που πραγματοποιήθηκε μόνο σε μια περιοχή της Θράκης (Otranto et al., 2012b), καθώς και σε κρότωνες, που συλλέχθηκαν από σκύλους και εξετάστηκαν, μόνο με τη χρήση μοριακών μεθόδων (Latrofa et al., 2017b). Ωστόσο, υπάρχει ένδεια επιστημονικών δεδομένων, σχετικά με τη γεωγραφική κατανομή, την ταυτοποίηση των ειδών και τη γενετική ποικιλομορφία του παρασίτου αυτού στην Ελλάδα. Στην παρούσα μελέτη με σκοπό τη διερεύνηση της γεωγραφικής κατανομής του παρασίτου, συλλέχθηκαν δείγματα ιστοτεμαχίων δέρματος και κρότωνες από σκύλους. Ταυτόχρονα με τη συλλογή των δειγμάτων, πραγματοποιήθηκε η καταγραφή όλων των ατομικών στοιχείων του κάθε σκύλου με σκοπό τη περαιτέρω στατιστική ανάλυση. Η μελέτη περιελάμβανε τη μικροσκοπική εξέταση των ιστοτεμαχίων δέρματος, με σκοπό την ανεύρεση των δερματικών μιρκοφιλαριών και τη μορφολογική ταυτοποίηση τους. Συνολικά από τους 500 σκύλους οι 70 (14%, CI 95%, 11 to 17%) βρέθηκαν να είναι μολυσμένοι με δερματικές φιλάριες του γένους Cercopithifilariα. Συγκεκριμένα, ταυτοποιήθηκαν 2 είδη, το είδος Cercopithifilaria bainae και Cercopithifilaria sp. II. Επίσης, ταυτοποιήθηκε μορφολογικά ένα επιπλεόν αταυτοποίητο είδος Cercopithifilaria. Ακόμα, πραγματοποιήθηκε η μοριακή ανάλυση των ιστοτεμαχίων δέρματος, καθώς και ενός αντιπροσωπευτικού δείγματος από τους συλλεχθέντες κρότωνες, με τη μέθοδο της αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης (PCR), με σκοπό την ενίσχυση του μιτοχονδριακού γονιδίου cox1 (~304 ζεύγη βάσεων). Τα δείγματα, τόσο των ιστοτεμαχίων δέρματος, όσο και των κροτώνων, που βρέθηκαν θετικά στην παρουσία Cercopithifilaria, με τη μέθοδο της PCR, επεξεργάσθηκαν περαιτέρω με τη μέθοδο Sanger, κατά την οποία προσδιορίστηκε η νουκλεοδιτική αλληλουχία του γονιδίου cox1. Στη συνέχεια, επεξεργάστηκαν περαιτέρω, με σκοπό την πολλαπλή στοίχιση τους, χρησιμοποιώντας το ειδικό αυτοματοποιημένο λογισμικό βιοπληροφορικής BLAST (Basic Logic Alignment Serach Tool). Τα αποτελέσματα, που προέκυψαν από την ανάλυση, έδειξαν πως υπήρχε υψηλή νουκλεοτιδική συγγένεια με τις αλληλουχίες cox1 (99% με 100%) τού είδους C. bainae. Από τη μέθοδο BLAST προσδιορίστηκαν 7 συνολικά διαφορετικοί απλότυποι. Ο πιο συχνός απλότυπος ήταν ο απλότυπος I, ο απλότυπος XVIII, και εν συνεχεία ο απλότυπος II και IX. Επιπροσθέτως, ταυτοποιήθηκαν τρεις νέοι απλότυποι, XIX, XX και XXI με υψηλή νουκλεοτιδική συγγένεια (99,58%) με τις αλληλουχίες cox1 του είδους C. bainae. Οι αλληλουχίες, που προέκυψαν από τη μέθοδο Sanger, επεξεργάστηκαν με σκοπό τη φυλογενετική ανάλυση. Το φυλογενετικό δένδρο που προέκυψε, ομαδοποίησε όλους τους απλοτύπους, που βρέθηκαν στην παρούσα εργασία, σε ένα μονοφυλετικό κλάδο του είδους C. bainae, γεγονός που υποστηρίζεται επιπλέον, από τη σχετικά υψηλή τιμή του παράγοντα bootstrap (99%). Από τη στατιστική ανάλυση για τη διερεύνηση των διαφόρων παραγόντων επικινδυνότητας, προέκυψε πως διάφοροι ατομικοί παράγοντες των σκύλων σχετίζονται και προδιαθέτουν για μόλυνση, από τα είδη Cercopithifilaria. Ανάμεσα στους διαφόρους παράγοντες επικινδυνότητας συμπεριλαμβάνονται, ο χώρος διαβίωσης, το βάρος, το ιστορικό προσβολής από κρότωνες, καθώς και η χρήση εξω-παρασιτοκότνων σκευασμάτων. Η περαιτέρω μελέτη της επιδημιολογίας και γεωγραφικής κατανομής των παρασίτων Cercopithifilaria, καθώς και η διερεύνηση των υποκείμενων μηχανισμών παθογένειας, του βιολογικού κύκλου και της μεγάλης γενετικής ποικιλομορφίας είναι αναγκαία, με σκοπό να απαντηθούν αρκετά ερευνητικά ερωτηματικά. Τέλος, τονίζεται η ανάγκη για ενημέρωση των κτηνίατρων της χώρας, σχετικά με την παρουσία των νηματωδών παρασίτων στους σκύλους και τις διαθέσιμες μεθόδους διάγνωσης και πρόληψης.