Χαρακτηρισμός του Bacillus subtilis MBI600 ως παράγοντα βιολογικής καταπολέμησης φυτοπαθογόνων και επαγωγής της ανάπτυξης φυτών

Abstract

Η χρήση ωφέλιμων μικροοργανισμών στην σύγχρονη γεωργία δεν αποτελεί πλέον εξαίρεση αλλά είναι απαραίτητη σε όλες τις καλλιεργητικές στρατηγικές. Τα ωφέλιμα ριζοβακτήρια αποτελούν ένα σημαντικό μέρος των εμπορικών σκευασμάτων, εξαιτίας της ικανότητας τους να προωθούν την ανάπτυξη των φυτών και να είναι αποτελεσματικά έναντι παθογόνων μικροοργανισμών. Βακτήρια που ανήκουν στο γένος Bacillus, αποτελούν την πλειοψηφία των μικροοργανισμών που διατίθενται εμπορικά ως παράγοντες βιολογικής καταπολέμησης ασθενειών των φυτών. Το εμπορικό σκεύασμα Serifel® , εμπεριέχει τον βιολογικό παράγοντα BacillussubtilisMBI600 (BsMBI600), και στην παρούσα διατριβή παρουσιάζεται μια συστηματική καταγραφή των μηχανισμών δράσης του συγκεκριμένου ωφέλιμου μικροοργανισμού. Για την καλύτερη κατανόηση των μηχανισμών δράσης του BsMBI600, πραγματοποιήθηκε αλληλούχιση του γονιδιώματος του μικροοργανισμού με Illumina HiSeq X. Τα αποτελέσματα της ανάλυσης ανέδειξαν γονίδια που σχετίζονται με την παραγωγή ουσιών που δρουν ως σήματα επικοινωνίας με τα φυτά-ξενιστές, οδηγώντας σε επιτυχημένο αποικισμό των ριζών. Επιπλέον, ταυτοποιήθηκαν γονίδια που σχετίζονται με την ικανότητα των βιολογικών παραγόντων να αυξάνουν την διαθεσιμότητα των θρεπτικών στοιχείων των φυτών, αλλά και την παραγωγή φυτοορμονών που οδηγούν στην προαγωγή της ανάπτυξης των φυτών. Τέλος, ταυτοποιήθηκαν γονίδια που σχετίζονται με την παραγωγή αντιμικροβιακών ουσιών, στο γονιδίωμα το BsMBI600.H ικανότητα αποικισμού του BsMBI600 σε ρίζες φυτών τομάτας και αγγουριάς, μελετήθηκε σε διαφορετικά υποστρώματα ανάπτυξης. Βακτηριακά κύτταρά του στελέχους, μετασχηματίσθηκαν με την εισαγωγή μια κίτρινης φθορίζουσας πρωτεΐνης, με τον τρόπο της φυσικής ιδιότητας των βακτηρίων να επιτρέπουν την εισαγωγή ξένων μορίων μέσα στο κύτταρο τους (naturaltransformation). Τα μετασχηματισμένα στελέχη του BsMBI600, μελετήθηκαν με την χρήση ανεστραμμένου φθορίζοντος μικροσκοπίου, και καταγράφηκε ο επιφυτικός αποικισμός 48 ώρες μετά την εφαρμογή. Εν συνεχεία, καταγράφθηκε η ικανότητα αποικισμού σε διαφορετικά υποστρώματα ανάπτυξης (κύβοι υδροπονίας, 2 τύποι εδαφών και αποστειρωμένο σύστημα). Ο βιολογικός παράγοντας BsMBI600, κατάφερε να αποικίσει το ριζικό σύστημα των 2 ξενιστών σε όλα τα υποστρώματα, με μεγάλες διακυμάνσεις στην διάρκεια και στην επιβίωση βακτηριακών κυττάρων, οδηγώντας στο συμπέρασμα, πως το εδαφικό υπόστρωμα παίζει σημαντικό ρόλο στην ικανότητα αποικισμού.Η ικανότητα του BsMBI 600 να προάγει την ανάπτυξη των φυτών αλλά και να ελέγχει σημαντικά παθογόνα των 2 ξενιστών, επιβεβαιώθηκε από ένα σύνολο πειραμάτων που πραγματοποιήθηκαν. Εφαρμογές με τον βιολογικό παράγοντα, οδήγησαν σε φυτά που παρουσίασαν αύξηση σε διάφορους παράγοντες (μήκος στελέχους και ρίζας, φωτοσύνθεση κ.α.). Η βιολογική δράση του έναντι φυτοπαθογόνων μικροοργανισμών επιβεβαιώθηκε τόσο με invitro πειράματα, όσο και με πειράματα σε φυτοδοχεία. Ο BsMBI600 μείωσε την εμφάνιση και την ένταση σημαντικών ασθενειών που προκαλούνται από τα παθογόνα Rhizoctonia solani, Pythium ultimum, P. Aphanidernatum,Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici -Forl, F. oxysporum f.sp. radicis cucumerinum- Forc, και Botrytiscinerea. Μέρος των μηχανισμών που εμπλέκονται στην επαγωγή της ανάπτυξης και της άμυνας των φυτών μελετήθηκαν με ανάλυση της έκφρασης γονιδίων σε φυτά αγγουριάς και τομάτας που δέχθηκαν εφαρμογή με τον BsMBI600. Οι μετρήσεις της γονιδιακής έκφρασης έδειξαν την ενεργοποίηση γονιδίων που σχετίζονται με την άμυνα του φυτού έναντι φυτοπαθογόνων μικροοργανισμών (PR-proteins, POD, GluA). Επίσης καταγράφηκε υπερέκφραση γονιδίων που σχετίζονται με παραγωγή ουσιών όπως αιθυλένιο, ιασμονικο οξύ και κινάσες, που είναι γνωστό ότι λειτουργούν ως σήματα της επαγωγής διασυστηματικής αντοχής. Τέλος, καταγράφηκε υπερέκφραση γονιδίων που σχετίζονται με την παραγωγή φυτοορμονών, οδηγώντας στο συμπέρασμα πως η εφαρμογή με τον βιολογικό παράγοντα συμβάλει στην επαγωγή της ανάπτυξης των φυτών τομάτας και αγγουριάς μέσω της ενεργοποίησης παραγωγής ενδογενών φυτοορμονών. Τέλος μελετήθηκε η αλληλεπίδραση μεταξύ του βιολογικού παράγοντα και του φυτοπαθογόνου μύκητα B. cinerea. Οι αντιμικροβιακές ουσίες που παράγονται από τον BsMB600 συμβάλλουν στον άμεσο τρόπο δράσης του έναντι του παθογόνου. Μέσω μεταγραφωμικής ανάλυσης σε στέλεχος του B. cinerea μετά την έκθεση του στις παραπάνω ουσίες, ταυτοποιήθηκαν μηχανισμοί που σχετίζονται με την αποτοξικοποίηση ξενοβιοτικών ουσιών (ABC, MFStransporters). H διαγραφή του γονιδίου mfs1 σε στελέχη τουμύκητα, έδειξε πως επηρεάζονται ορισμένες λειτουργίες του, αλλά και η αντιμετώπιση του από τον βιολογικό παράγοντα.