Оптимизация Выделения МтДНК Из Клубней Картофеля С Использованием Различных Сорбционных Носителей И Разной Степени Очистки Митохондрий

Abstract

В настоящее время существует интерес к оценке повреждений мтДНК как к маркеру окисли-тельного стресса, при этом данный вопрос недостаточно изучен для мтДНК растений. Однако мито-хондриальный геном растений обладает рядом особенностей, которые могут существенно затруднять проведение ПЦР. При недостаточной очистке митохондрий пробы всё ещё могут быть контаминиро-ваны ядерной и пластидной ДНК, что может привести к неспецифичному отжигу праймеров. Целью данной работы является оптимизация процесса выделения мтДНК из картофеля (Solanum tube- rosum L.) при использовании различных сорбционных носителей. Применение методов сорбции на твердофазных носителях является наиболее эффективным для крупных по размерам молекул мтДНК. Нами было проведено сравнение эффективности трёх коммерческих наборов для выделения ДНК: diaGene (Диа-М, Россия), Проба-ГС (ДНК-Технология, Россия) и Plasmid miniPrep (Evrogen, Россия). Эти методы подразумевают связывание ДНК с поверхностью сорбционных колонок (diaGene, Plasmid miniPrep), либо на силикатном сорбенте (Проба-ГС). Для оценки эффективности рассмотренных ме-тодов с помощью количественной ПЦР был измерен уровень обогащения мтДНК. Также приведено сравнение эффективности выделения ДНК при разных степенях очистки исходного материала – при использовании гомогената картофеля, при очистке дифференциальным и центрифугированием в гра-диенте Перколла. Низкий уровень насыщенности мтДНК наблюдался при выделении из гомогената, высокий – при выделении митохондрий градиентным центрифугированием. При использовании гра-диентного центрифугирования высокий уровень обогащения мтДНК наблюдался только при выделе-нии ДНК набором Проба-ГС. Нами было обнаружено, что наибольшим насыщение материала мтДНК будет при использовании набора Plasmid miniPrep при предварительной очистке митохондрий гради-ентным центрифугированием. Только градиентное центрифугирование способно максимально очи-стить митохондрии от примесей. Использование набора Plasmid miniPrep, предназначенного для вы-деления плазмидной ДНК, показывает свою эффективность и для мтДНК, которые аналогично пла-стидным ДНК являются преимущественно кольцевыми. В результате удалось разработать оптимизи-рованный процесс выделения мтДНК картофеля, пригодного для проведения дальнейших молекуляр-но-генетических исследований. Этот метод может быть использован для любых научных изысканий, связанных с изучением митохондриального генома растений.