Создание Систем Редактирования Генома На Основе Crispr-Cas9 Для Нокаута Генов Fgf20 И Hr В Эмбриональных И Генеративных Клетках Кур И Перепелов

Abstract

Технологии геномного редактирования с применением сайт-специфических эндонуклеаз (ZNF, TALEN, CRISPR/Cas9) находят все более широкое применение в животноводстве, в том числе в птицеводстве. С их использованием связывают надежды не только на ускорение процесса создания пород с улучшенными хозяйственно полезными признаками, высокой устойчивостью к инфекционным заболеваниям, но и с созданием особей, несущих фенотипы, привнесение которых в популяции животных и птицы методами традиционной селекции невозможно или затруднено. Одним из направлений применения технологии геномного редактирования, представляющим интерес для промышленного птицеводства в рамках улучшения товарных качеств птицеводческой продукции, может быть создание особей, лишенных оперения. Для этого мы выбрали гены FGF20 и HR, связанные с развитием и ростом волос у млекопитающих (F. Benavides с соавт., 2009) и перьев у птиц (K.L. Wells с соавт., 2012). Цель исследования заключалась в создании системы для нокаута генов FGF20 и HR у кур и FGF20 у перепелов с использованием методов редактирования генома. Инактивацию генов FGF20 и HR проводили в области III экзона каждого гена с учетом анализа их структуры. С использованием биоинформатического инструментария и ресурсов (https://zlab.bio/guide-design-resources, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) были подобраны оптимальные участки разрезания генов FGF20 и HR, а также гидовые РНК и праймеры для амплификации выбранных участков этих генов. Для создания генетических конструкций, обеспечивающих разрезание в областях, кодирующих FGF20 и HR, был выбран вектор pX458 (F.A. Ran с соавт., 2013). Для лигирования использовали гибридизованные олигонуклеотиды: 5´-CACCGAAAGATGGTACTCC-CAGAGA-3´ и 3´-CTTTCTACCATGAGGGTCTCTCAAA-5´ (для гена FGF20 кур), 5´-CACCGTCC-ATGTTTGTACACGTTGG-3´ и 3´-CAGGTACAAACATGTGCAACCCAAA-5´ (для гена FGF20 кур и перепелов); 5´-CACCGACGTGGCTGACGCGGCACT-3´ и 3´-CTGCACCGACTGCGCCA-5´ (для гена HR кур). Эффективность клонирования конструкций подтвердило секвенирование. Полученные плазмиды использовались для редактирования генома эмбриональных (фибробласты) и генеративных (примордиальные зародышевые клетки -ПЗК, сперматогонии) клеток кур и перепелов в экспериментах in vitro. Клетки-мишени трансфицировали посредством электропорации. Эффективность трансфекции оценивали на сортере клеток BD FacsAria III («BD Biosciences», США) по экспрессии маркерного гена eGFP. Доля трансфицированных in vitro эмбриональных фибробластов, ПЗК и сперматогониев кур с нокаутом гена FGF20 достигала соответственно 5,7; 0,9 и 1,2 %, с нокаутом гена HR -7,4, 0,8 и 1,0 %. Процент эмбриональных фибробластов, ПЗК и сперматогониев перепелов с нокаутом гена FGF20 составил соответственно 6,3; 0,9 и 1,1 %. Геномная ДНК была выделена из трансформированных клеток кур и перепелов и использована для амплификации и секвенирования участков генов FGF20 и HR, в которые были внесены делеции. Показано наличие множественных мутаций в амплифицированных участках ДНК. Полученные данные свидетельствуют об успешности создания систем для нокаута генов FGF20 и HR у ...