ФЕРМЕНТЫ ДЕГРАДАЦИИ РАМНОГАЛАКТУРОНАНА I КАК ФАКТОРЫ ВИРУЛЕНТНОСТИ ФИТОПАТОГЕННОЙ БАКТЕРИИ Pectobacterium atrosepticum

Abstract

Фитопатогенные пектобактерии (род Pectobacterium) известны как возбудители мягких (мокрых) гнилей. Симптомы мягких гнилей связаны с обширной мацерацией растительных тканей вследствие продукции микроорганизмами ферментов, разрушающих компоненты растительных клеточных стенок. Большинство ферментов, секретируемых пектобактериями, катализируют расщепление гомогалактуронана. Этот полисахарид, представляющий собой линейный гомополимер, состоит из остатков галактуроновой кислоты и является основным (по массе) пектиновым полисахаридом растительных клеточных стенок. Известно, что нокаут генов ферментов деградации гомогалактуронана приводит к снижению вирулентности пектобактерий. В то же время при инфекции, вызываемой пектобактериями, происходит модификация другого типа пектинов-рамногалактуронана I. Это разветвленный гетерополимер, остов которого построен из чередующихся остатков рамнозы и галактуроновой кислоты, а боковые цепи-из остатков галактозы или арабинозы. Однако роль пектобактериальных ферментов, разрушающих рамногалактуронан I, в развитии мягких гнилей не выявлена. Цель настоящей работы заключалась в проверке необходимости ферментов P. atrosepticum SCRI1043, разрушающих рамногалактуронан I, для полноценного развития мягких гнилей в растениях, инфицированных пектобактериями. С помощью направленного мутагенеза мы получили мутантные формы P. atrosepticum SCRI1043 по генам, кодирующим ферменты, расщепляющие рамногалактуронан I. В качестве целевых для нокаута были выбраны гены, кодирующие рамногалактуронил гидролазу (геномный локус eca3749), расщепляющую остов рамногалактуронана I, и галактаназу (геномный локус eca0852), отщепляющую боковые цепи этого полимера. Для нокаута целевых генов конструировали мутантные локусы с помощью ПЦР по методу перекрывающегося сплайсинг-расширения. Большую часть кодирующей области гена удаляли, а на ее место встраивали кассету устойчивости к канамицину. Полученную конструкцию лигировали в суицидный мобилизуемый вектор pKNG101, и сконструированную таким образом плазмиду переносили в клетки донорного штамма Escherichia coli СС118. Рекомбинантную плазмиду с мутантным локусом вводили в клетки P. atrosepticum SCRI1043, используя трехродительское скрещивание. Клоны P. atrosepticum SCRI1043, в которых проходила замена исходного локуса на мутантный и элиминация донорной плазмиды, отбирали на селективных средах. Мутантные по локусам ECA3749 и ECA0852 штаммы P. atrosepticum приводили к значительно менее интенсивному повреждению тканей растений пекинской капусты (Brassica rapa spp. pekinensis) сорта Cha Cha по сравнению с родительским штаммом дикого типа. При этом наименьшую вирулентность проявлял штамм, мутантный по локусу eca0852, кодирующему галактаназуфермент, расщепляющий боковые цепи рамногалактуронана I. Снижение вирулентности при этом не было связано с подавлением активности ферментов, расщепляющих гомогалактуронан, или с меньшей подвижностью бактерий. Таким образом, ферменты деградации рамногалактуронана I могут быть отнесены к факторам вирулентности фитопатогенных пектобактерий, а гидро...