La mora de Castilla (Rubus glaucus Benth.) es considerada en Colombia como uno de los frutales con mayor potencial agrícola. Sin embargo, no cuenta con esquemas de aseguramiento de la calidad para la propagación de material de siembra. Para dar solución a esta problemática se ha recurrido al uso de herramientas como la propagación in vitro. Sin embargo, aún se desconoce la acción que ejercen algunos factores como el medio de cultivo. Por lo anterior, el objetivo del presente estudio fue evaluar diferentes medios de cultivo para el establecimiento, multiplicación y enraizamiento in vitro de mora de Castilla, con la finalidad de obtener un protocolo para la producción de material de propagación con características de calidad genética y sanitaria. Para ello, se evaluaron ocho de los principales medios de cultivo basales suplementados con dos concentraciones de reguladores de crecimiento para un total de 16 tratamientos, cada uno con tres repeticiones de 10 unidades experimentales por etapa, los cuales fueron dispuestos en un diseño completamente al azar. Para el establecimiento, el mejor medio de cultivo fue el Murashige y Skoog (MS) en combinación con 2 mg L -1 de ácido giberélico. Para la multiplicación los mejores resultados se observaron en el medio MS suplementado con 0,75 mg L -1 de bencilaminopurina, mientras que para el enraizamiento los valores más altos se presentaron en el medio MS en combinación con 1 mg L -1 de ácido indol butírico.