ABSTRACT. The treatment of acute lymphoblastic leukemia is challenging due to side effects, efficacy of the available drugs, and costs. Utilization of L-asparaginase as a therapeutic agent is essential to increase survival of patients. However, costs are elevated and the bacterial forms of the enzyme cause reactions that result in its inhibition by the immune system. Therapeutics alternatives may be searched among eukaryote producers, like fungi. Twelve strains of filamentous fungi were evaluated regarding expression of L-asparaginase activity. The profile of nitrogen assimilation and radial growth were determined for strains which showed higher production ratios. Three media were formulated after selection of the carbon source and carbon/nitrogen ratio that better induced L-asparaginase expression by Penicillium sp. and Fusarium sp. The enzyme activity produced in liquid media reached 8.3 U min.-1 mL -1 (Penicillium sp. T6.2) and 11.4 U min.-1 mL -1 (Fusarium sp.) after 72 hours of cultivation in Bacelar-1 medium. These data show that good producers can be found among fungi, and adjustment of productive processes may offer an alternative to implement eukaryote L-asparaginase production.Keywords: therapeutic enzymes, filamentous fungi, acute lymphoblastic leukemia, Penicillium sp., Fusarium sp.Produção fúngica da enzima antileucêmica L-asparaginase: da triagem ao desenvolvimento de um meio de cultivo RESUMO. O tratamento da leucemia linfoblástica aguda é desafiador devido aos efeitos adversos, à eficácia dos fármacos disponíveis e aos custos envolvidos. A utilização de L-asparaginase como agente terapêutico é fundamental para aumentar a sobrevida do paciente. Porém, seu custo é elevado e as formas bacterianas da enzima causam reações que resultam na sua inibição pelo sistema imune. Alternativas terapêuticas podem ser buscadas entre produtores eucariontes, como os fungos. Doze linhagens de fungos filamentosos foram avaliadas quanto à expressão de atividade de L-asparaginase. O perfil de assimilação de nitrogênio e o crescimento radial foram determinados para as linhagens com maior razão de produção. Três meios foram formulados após a seleção da fonte de carbono e da razão carbono/nitrogênio que melhor induziram a expressão de L-asparaginase por Penicillium sp. e Fusarium sp. A atividade enzimática produzida em meio líquido alcançou 8,32 U min. (Fusarium sp.) após 72 horas de cultivo no meio Bacelar-1. Esses dados mostram que bons produtores podem ser encontrados entre os fungos e que ajustes nos processos produtivos podem oferecer uma alternativa para a implementação da produção de L-asparaginase eucarionte.Palavras-chave: enzimas terapêuticas, fungos filamentosos, leucemia linfocítica aguda, Penicillium sp., Fusarium sp.