Senyawa bioaktif pada tanaman gembili dapat dihasilkan lebih banyak dari kalus dibandingkan tanaman utuhnya. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh pemberian 2,4-D dan kinetin serta elisitor ekstrak khamir terhadap pertumbuhkan kultur kalus gembili. Rancangan penelitian yang digunakan adalah rancangan acak lengkap dua faktorial, yaitu kombinasi 2,4-D (1 ppm; 0,5 ppm) dan kinetin (1 ppm; 0,5 ppm) serta elisitor ekstrak khamir (0,5%; 1%; 2,5% (b/v)). Kalus berumur tiga bulan disubkultur dan diinkubasi selama 2,5 bulan. Kemudian dielisitasi dengan ekstrak khamir dan dipelihara selama 30 hari. Indikator pertumbuhan kalus yang diamati meliputi berat basah, warna dan tekstur kalus. Data dianalisis menggunakan ANOVA dua arah dan diuji lanjut dengan DMRT 5%. Hasil penelitian menunjukkan bahwa kombinasi 2,4-D dan kinetin berpengaruh terhadap rerata berat basah kalus. Sedangkan pemberian elisitor ekstrak khamir tidak berpengaruh terhadap rerata berat basah kalus gembili. Rerata berat basah kalus tertinggi sebesar 3,35 gram dicapai pada kombinasi 2,4-D 0,5 ppm + kinetin 0,5 ppm dengan elisitor 1% (b/v). Tekstur kalus yang dihasilkan pada seluruh perlakuan adalah remah dan berwarna coklat muda hingga coklat kehitaman.