Enzim protease merupakan kelompok enzim hidrolase yang menghidrolisis ikatan peptida menjadi oligopeptida dan asam amino. Enzim protease yang banyak dimanfaatkan adalah yang berasal dari bakteri. Penelitian ini melakukan penentuan kondisi optimum pertumbuhan bakteri, produksi, pemurnian dan karakterisasi pH, suhu, waktu inkubasi, pengaruh ion logam dan senyawa EDTA terhadap aktivitas enzim. Penentuan data kinetika dan termodinamika meliputi K M dan V maks pada subsrat kasein. Biakan bakteri yang ditumbuhkan pada kondisi optimum menunjukkan fase stasioner pertumbuhan tercapai pada waktu inkubasi 42 jam dengan aktivitas enzim sebesar 0,719 U/mL. Tahapan pemurnian enzim menghasilkan enzim dengan aktivitas berturut-turut sebesar 0,3894; 0,3621; dan 0,2259 U/mL. Karakterisasi enzim hasil pemurnian menunjukkan kondisi optimum aktivitas enzim pada pH 7, suhu 50 o C, dan waktu inkubasi 40 menit. Ion logam Na + dan Ca 2+ meningkatkan aktivitas protease, sedangkan ion Mn 2+ , Zn 2+ , Cu 2+ menurunkan aktivitas protease. Nilai V maks 0,6 µmol/mL menit sedangkan nilai K M sebesar 6,1 mg/mL substrat.