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La detección de patógenos asociados a semilla requiere contar con muestras representativas y homogéneas para obtener resultados confiables. Esta investigación tuvo como objetivos evaluar si: 1) el nivel de infección ( 5, 10 y 15 %); 2) el incremento del número de muestra simples (10, 15, 20 y 25), utilizadas para formar muestras compuestas; y 3) el incremento y la reducción del tamaño de muestra usual de 10% (establecido en el CIMMYT para el diagnóstico de plagas y enfermedades) a 15 y 5%, afectan la capacidad predictiva de la prueba DAS-ELISA al virus del mosaico estriado de la cebada (BSMV, por sus siglas en ingles). A partir de lotes de semilla de trigo harinero (Triticum aestivum L.), uno naturalmente infectado y otro sano, se formaron 210 muestras simples (MS), de 20 g cada una, divididas en grupos iguales de 70 muestras MS con 5, 10 y 15% de nivel de infección (NI) para formar tamaños de muestra (TM) de 15, 10 y 5%, y muestras compuestas (MC) con 10, 15, 20 y 25 muestras MS por NI y TM. Los resultados indicaron que al reducir el nivel NI en muestras MS de 15% a 10 y 5% decreció significativamente (α= 0.05) en 21 y 31.5%, respectivamente, la sensibilidad de la prueba al virus BSMV. Similarmente, la reducción del número de muestras MS para formar muestras MC afectó significativamente (α= 0.05) la sensibilidad de la prueba al virus e incrementó la probabilidad de registrar falsos negativos. Aunque el incremento y la reducción del TM de 10% a 15 y 5% afectó significativamente (α= 0.05) la sensibilidad de la prueba al virus no se encontró una relación lineal entre el TM de la muestra MC con el valor de absorbancia. Este estudio evidencia la importancia del nivel de infección del virus BSMV en la semilla, del TM y del número de MS en muestras MC para la obtención de resultados confiables por la prueba DAS-ELISA.