We assessed the fish assemblage structure and composition of Nova Ponte Reservoir (Araguari River, Upper Paraná Basin, Brazil). We observed significant differences in abundance (p = 0.0003), richness (p = 0.0005) and diversity (p = 0.02) between lacustrine and riverine zones of the reservoir. Nine species were significantly more abundant in the riverine region: Astyanax altiparanae, Astyanax gr. fasciatus, Galeocharax knerii, Hoplias intermedius, Hypostomus sp., Leporinus friderici, Leporinus obtusidens, Pimelodus maculatus and Schizodon nasutus. The results indicated a longitudinal gradient in the composition and abundance of fishes in Nova Ponte Reservoir, reinforcing the importance of freely flowing riverine reaches for conserving native neotropical ichthyofauna and reflecting the strong adaptation of these species to riverine systems.Keywords: fish community, Upper Paraná River Basin, spatial gradient. Variações espaciais na estrutura das assembléias de peixes em um reservatório do sudeste do Brasil ResumoEste estudo avaliou a assembléia de peixes do reservatório de Nova Ponte (rio Araguari, bacia do Alto Paraná, Brasil), em termos de estrutura e composição. Foram observadas diferenças significativas na abundância (p = 0.0003), riqueza (p = 0.0005) e diversidade (p = 0.02) entre as zonas lacustres e fluviais do reservatório. Nove espécies foram mais abundantes na região fluvial: Astyanax altiparanae, Astyanax gr. fasciatus, Galeocharax knerii, Hoplias intermedius, Hypostomus sp., Leporinus friderici, Leporinus obtusidens, Pimelodus maculatus and Schizodon nasutus. Os resultados indicaram a existência de um gradiente longitudinal na composição e abundância de peixes no reservatório de Nova Ponte. Estes padrões reforçam a importância de trechos fluviais livres de barramentos para a conservação da ictiofauna neotropical nativa e refletem a forte adaptação dessas espécies aos sistemas fluviais.Palavras-chave: comunidade de peixes, Bacia do Alto Rio Paraná, gradiente espacial.