Introducción. La resistencia bacteriana ha tomado importancia en salud pública, requiriendo establecer las relaciones existentes entre las infecciones, el manejo terapéutico y la expresión de los mecanismos de resistencia en microorganismos aislados en muestras hospitalarias. Objetivo. Reportar el perfil de resistencia de los microorganismos identificados en una institución prestadora de servicios de salud de tercer y cuarto nivel de atención en el Departamento de Boyacá durante un periodo de 6 meses en el año 2018. Materiales y métodos. Se llevó a cabo un estudio observacional, descriptivo y de corte transversal; los microorganismos fueron aislados de muestras clínicas de una institución prestadora de salud del departamento de Boyacá durante un periodo de 6 meses en el año 2018. Se realizó identificación, concentración mínima inhibitoria y pruebas confirmatorias de susceptibilidad según la Clinical and Laboratory Standards Institute M100-S23. Resultados. En los aislados evaluados predominaron los bacilos Gram negativos con un 86,4 % de estas 50% presentaron el fenotipo de resistencia Betalactamasas de espectro extendido, siendo Escherichia coli el microorganismo más frecuente. Staphylococcus aureus fue el único microorganismo Gram positivo aislado con 100% de cepas resistente a meticilina.  Conclusiones. El microorganismo aislado con mayor frecuencia fue Escherichia coli y el mecanismo de resistencia más prevalente fue la producción de Betalactamasas de espectro extendido aisladas de muestras de orina.