The relationship between parasitic wasps and bracoviruses constitutes one of the few known mutualisms between viruses and eukaryotes. The virions produced in the wasp ovaries are injected into host lepidopteran larvae, where virus genes are expressed, allowing successful development of the parasite by inducing host immune suppression and developmental arrest. Bracovirus-bearing wasps have a common phylogenetic origin, and contemporary bracoviruses are hypothesized to have been inherited by chromosomal transmission from a virus that originally integrated into the genome of the common ancestor wasp living 73.7 ؎ 10 million years ago. However, so far no conserved genes have been described among different braconid wasp subfamilies. Here we show that a gene family is present in bracoviruses of different braconid wasp subfamilies (Cotesia congregata, Microgastrinae, and Toxoneuron nigriceps, Cardiochilinae) which likely corresponds to an ancient component of the bracovirus genome that might have been present in the ancestral virus. The genes encode proteins belonging to the protein tyrosine phosphatase family, known to play a key role in the control of signal transduction pathways. Bracovirus protein tyrosine phosphatase genes were shown to be expressed in different tissues of parasitized hosts, and two protein tyrosine phosphatases were produced with recombinant baculoviruses and tested for their biochemical activity. One protein tyrosine phosphatase is a functional phosphatase. These results strengthen the hypothesis that protein tyrosine phosphatases are involved in virally induced alterations of host physiology during parasitism.

A recombinant Anticarsia gemmatalis multicapsid nucleopolyhedrovirus (AgMNPV) expressing beta-galactosidase under the control of the polyhedrin promoter was generated in our laboratory. To this end, we cloned the AgMNPV-2D genomic DNA fragment containing the polh gene and subcloned and sequenced the polyhedrin gene and its flanking regions. Based on this sequence information, sets of primers were designed to amplify the flanking regions by PCR, including appropriate restriction sites. The transfer vector (pAgPHZ) was constructed by the consecutive cloning of these PCR fragments flanking the Escherichia coli LacZ gene, in place of the polh gene. pAgPHZ was used for cotransfection of UFL-AG-286 insect cells with AgMNPV-2D DNA and the required recombinant, generated by homologous recombination with the polh locus, was identified by its polh(-)/LacZ+ plaque phenotype. Its genome structure was confirmed by PCR, restriction digestion and Southern blot analyses. The kinetics and levels of expression of beta-galactosidase in UFL-AG-286 cells infected with the recombinant were tested by SDS-PAGE and enzymatic activity assays.

La “oruga de las leguminosas” Anticarsia gemmatalis (Lepidoptera: Noctuidae) es una plaga con amplia difusión geográfica, que afecta principalmente al cultivo de soja. En Brasil se desarrolló un bioinsecticida en base al baculovirus AgMNPV para el control de esta plaga, y su aplicación exitosa en más de un millón de hectáreas de soja, representó un ahorro significativo del presupuesto utilizado anteriormente en insecticidas químicos (Moscardi, 2002). En Argentina, esta plaga ha sido controlada durante las últimas décadas mediante el uso de insecticidas piretroides. En la actualidad, se han debido incrementar las dosis y el número de aplicaciones (de una a dos o tres por campaña), lo cual estaría indicando la aparición de variedades resistentes a estos pesticidas (Gamundi, com. pers.). En tales circunstancias, existe una creciente demanda de productos alternativos para su control. El inconveniente más significativo que limita la utilización más amplia de AgMNPV es su baja velocidad de acción, aspecto negativo que se acentúa en regiones templadas como nuestro país (Moscardi, 1999). Otro aspecto que genera interés en relación al estudio de los baculovirus, es su utilidad como vectores muy eficientes para la expresión de genes heterólogos (Luckow y Summers, 1988, O’Reilly eí al., 1992; King y Posse, 1992). El gran tamaño del genoma viral requiere la utilización de la recombinación homologa para introducir cambios dirigidos (Kitts y Possee, 1993; Pfeifer et al., 1997). Recientemente, esta metodología se utilizó con el objetivo de incrementar la potencia insecticida de los baculovirus salvajes. Se ensayaron distintas alternativas, que incluyen la expresión de toxinas específicas para insectos, hormonas de insecto o enzimas o deleciones de genes virales que afectan la metamorfosis (Wood y Granados, 1991, O’Reilly etal., 1991; Chejanovsky etal., 1995, Bonning y Hammock, 1996). En 1994 Cory et al. publicaron el primer trabajo en el que se utilizaron baculovirus mejorados genéticamente en un ensayo de campo. En este contexto, se inició el presente proyecto de Tesis, con el objeto de desarrollar un sistema de producción de recombinantes del virus de la poliedrosis nuclear de Anticarsia gemmatalis (rAgMNPV) que permitiera tanto la generación de AgMNPVs con mayor eficacia bioinsecticida contra plagas de la soja, como su utilización para la expresión de genes foráneos en un ambiente eucariota. Para ello, se localizó, clonó y secuenció el gen de la poliedrina (polh) de AgMNPV y sus regiones flanqueantes; se construyeron vectores de transferencia para la recombinación homologa con el locus polh y se desarrolló el primer sistema de expresión basado en AgMNPV (Arana et al., 2001). Por otra parte, se demostró la eficacia del sistema para la expresión de genes foráneos, a niveles muy altos y biológicamente activos (Arana et al., 2001; Arana et al.,2002). Mediante la utilización de dicho sistema se aislaron y caracterizaron recombinantes de AgMNPV que expresan una proteína neurotóxica (Txp I), específica de insectos. Los resultados obtenidos a partir de insectos tratados con estos recombinantes demostraron la eficacia de la modificación genética realizada. Se comprobó una disminución del 55-60% en el tiempo de muerte de larvas infectadas por el virus recombinante, en comparación con el producido por el virus silvestre. Los objetivos alcanzados sientan las bases para posteriores estudios de impacto ecológico del recombinante obtenido, con el fin de cumplimentar los requisitos imprescindibles para el registro del rAgMNPV como insecticida biológico de utilidad en esta región. Finalmente, los vectores de transferencia generados en el marco del proyecto permiten la potencial utilización del sistema para la expresión de dos o más genes con funciones relacionadas (subunidades proteicas). Este tipo de construcciones podría resultar importante desde el punto de vista biotecnológico para la producción masiva de estructuras proteicas complejas (antígenos, complejos multienzimáticos, etc.).