A leishmaniose é uma importante zoonose parasitária, tendo os flebotomíneos como vetores biológicos. Por ser uma doença de epidemiologia complexa, outros artrópodes têm sido apontados como possíveis transmissores da enfermidade, especialmente nas áreas onde existem surtos da doença sem a presença do Lutzomyia spp. O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrência da infecção natural de Culex quinquefasciatus por Leishmania spp. em áreas endêmicas para leishmaniose humana e animal. Os insetos foram capturados em duas associações protetoras dos animais, uma delas situada no município de Andradina e a outra em Ilha Solteira-SP, utilizando armadilhas luminosas. Os mosquitos capturados foram mortos por congelamento e separados em grupos identificados com o local de origem e a espécie. Os insetos do gênero Culex sp.  foram separados e macerados formando um pool em solução fisiológica estéril 0,9%, congelados e enviados para análise laboratorial por meio da técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR). Amplificação positiva para Leishmania chagasi foram encontradas em 12,5% (2/16) das amostras provenientes da cidade de Ilha Solteira, SP. Este é o primeiro relato da infecção natural de mosquitos Culex sp. por protozoários do gênero Leishmania chagasi em todo o mundo.