Pengembangan instrumen two tier test ini digunakan untuk mengetahui keterampilan berpikir kritis ekosistem siswa. Berpikir kritis siswa meliputi interpretasi, analisis, evaluasi, kesimpulan, interpretasi dan regulasi diri. Berpikir kritis diperlukan dalam meningkatkan kualitas pendidikan. Penelitian ini bertujuan untuk menghasilkan instrumen two-tier test yang valid dan reliabel untuk mengetahui keterampilan berpikir kritis materi ekosistem.  Penelitian dan pengembangan dengan menggunakan model pengembangan 4D (Define, Design, Develop, and Disseminate). Instrumen diujikan kepada dua validator ahli dan 35 siswa. Untuk menguji tingkat keberhasilan tes, maka digunakan uji validasi, reliabilitas, dan analisis butir soal. Analisis butir soal yang digunakan adalah tingkat kesulitan soal dan daya beda. Berdasarkan hasil uji coba produk diperoleh 10 soal yang valid dan 5 soal tidak valid. Hasil reliabilitas tes sebesar 0,671 dengan interpretasi bahwa 45% responden menilai instrumen yang dikembangkan dapat dipercaya (reliabel). Selain itu, 10 soal dengan kategori sulit, dan 5 soal kategori sedang. Daya beda soal menunjukkan 1 soal kategori baik sekali, 6 soal kategori baik, 4 soal kategori cukup, dan 4 soal kategori kurang. Sehingga dapat disimpulkan, instrumen two tier test berpikir kritis ekosistem dalam bentuk pilihan ganda yang telah dikembangkan valid dan reliabel.